永生化人胰腺基质细胞系(3223)-hTERT+SV40T 维修保养手册

环境稳定性巡检清单

培养箱每 24 h 记录一次温度与 CO₂ 浓度，允许误差 ±0.2 °C 与 ±0.1 %。每月拆洗水盘并更换无菌去离子水，防止真菌挥发孢子落入培养皿。遇到断电重启，先将箱内温度拉回 37 °C 再置入细胞，避免温度冲击造成端粒酶瞬时下调。

培养基防衰策略

FBS 批次差异是漂移的最大诱因。建立 3 批平行试养模型：新批次血清与旧批次按 1:1 混匀培养 3 代，测倍增时间、细胞直径、IL-6 分泌量三项指标。任一指标波动超过 10 %，整批血清封存退货。ITS-X、EGF 等添加因子开封后 4 °C 避光保存 30 天，过期直接丢弃，绝不延长使用。

支原体隐形污染排查

每月第一周执行“两周双检"：第一周荧光法初筛，第二周 PCR 复核。出现可疑荧光点即刻启动隔离流程，阳性皿封盖后直接高压灭活。环境对照皿同步培养，确认污染源来自细胞而非试剂或操作。污染史写入批次履历，方便后续回溯。

代数红线管理

实验室内部规定：P0–P30 为黄金期，P31–P50 为警戒期，P51 起进入淘汰池。警戒期每 3 代抽检核型与端粒长度，发现非整倍体或端粒 <6 kb 立即降级为饲养层细胞使用，不再用于分子实验。淘汰池细胞统一做支原体、核型、STR 终检后封存，避免误用。

冻存库分级备份

液氮罐分 A、B、C 三区：A 区日常取用，B 区半年备份，C 区异地灾备。每支冻存管贴二维码，扫码即可读取复苏日期、代数、操作人。A 区每支细胞限用 3 次，第 3 次后转入 B 区封存。C 区每年更新一次，确保灾难恢复能力。

复苏后“慢启动"协议

复苏当天仅更换一次培养基，48 h 内不消化传代，让细胞从 DMSO 应激中恢复。第 3 天开始按 1:3 比例传代，连续 3 代倍增时间稳定在 24 h 以内再进入正式实验。复苏后首代禁止做任何药物处理，防止应激-药物协同毒性导致功能缺失。

交叉污染防火墙

同一操作台不允许多人同时处理不同细胞系。使用独立移液器与吸头盒，台面 75 % 酒精擦拭后紫外照射 30 min。每月进行一次 STR 抽查，与入库图谱比对，任何位点差异 >1 个重复序列即启动全库排查。排查期间所有相关实验暂停，直至污染源定位。

数据化保养日志

建立在线表单记录每一次换液、传代、冻存、复苏的时间、代数、操作者、试剂批号。系统自动计算倍增时间与代数，提前 3 代邮件提醒进入警戒期。数据公开给全组，任何人都能实时查看细胞健康趋势，减少人为记忆误差。