永生化子宫内膜基质细胞 SV40+hTERT 的工作原理

双基因协同：突破衰老的两道闸门

原代子宫内膜基质细胞在体外经历复制衰老，主要由 p53/p21 和 Rb/p16 通路触发。SV40 大 T 抗原（SV40T）通过结合 p53 与 Rb 蛋白，解除细胞周期阻滞；hTERT 补充端粒酶活性，维持端粒长度。两条通路同时失活，细胞获得持续增殖能力。实验显示，单独表达 SV40T 的细胞在第 25 代出现端粒缩短危机，联合表达 hTERT 后增殖曲线保持指数型，倍增时间稳定在 24–28 h。

端粒动力学：实时观测永生化的分子证据

采用 Telomere PNA-FISH 结合 Flow-FISH 技术，可在活细胞水平监测端粒长度。永生化株的平均端粒荧光强度维持在 8–10 kb 区间，原代对照在第 20 代下降至 5 kb 以下。荧光信号呈均匀分布，说明群体遗传均一。若观察到端粒长度异质性增大，提示亚群分化或基因组不稳定，需要单克隆再筛选。

表型锁定：雌激素受体与蜕膜化潜能

永生化并未牺牲组织特异功能。Western blot 检测 ERα、ERβ 表达量与原代差异＜15 %。体外蜕膜化模型（8-Br-cAMP + E2 + P4 处理 72 h）中，IGFBP-1 分泌量可达 3.5 μg/mL，与临床原代样本一致。关键转录因子 FOXO1 核转位效率＞80 %，表明信号通路完整。功能缺失常见于 hTERT 过表达量过高（>5 倍内源水平），需通过慢病毒滴度梯度实验优化 MOI=2–3。

基因组稳定性：超越核型快照的深度测序

常规 G-banding 仅能检测 >5 Mb 的结构变异。采用 low-pass WGS（0.5×）结合 CNV 分析，可识别 100 kb 级拷贝数变化。永生化株在 30 代内 CNV 负荷指数（每 Mb 的 CNV 数目）<0.05，与早期原代接近。热点区域 8q24.21（包含 MYC）拷贝数增加 1.2–1.4 倍属常见漂移，不影响功能。若检测到 3p14.2（FOXP1 区域）缺失，需立即弃用该批次。

免疫逃逸：与 T 细胞共培养读出

永生化过程可能激活 cGAS-STING 通路，导致 IFN-β 分泌升高。建立 Jurkat 共培养体系：效应/靶比 5:1，48 h 后检测 CD69 表达。合格株诱导的 CD69+ T 细胞比例＜10 %，与原代无差异。若比例超过 20 %，提示细胞表面 MHC-I 表达异常，需加做 β2-微球蛋白敲低或 B2M 基因编辑修复。

冻存唤醒：分子记忆与复苏速率

液氮冻存 6 个月后端粒长度下降 <3 %，复苏 24 h 内端粒酶活性恢复至冻前水平。关键步骤：DMSO 浓度 10 %，降温速率 -1 °C/min，37 °C 水浴 90 s 快速复苏。复苏后第 1 代不做任何药物筛选，防止应激诱导 p16 反弹。第 2 代起加入 0.5 μg/mL puromycin 维持 SV40T 表达，避免基因沉默。

应用窗口：何时替换新批次

建立实验室内部代数红线：核型异常率 >5 %、端粒长度 <6 kb、倍增时间 >36 h、蜕膜化 IGFBP-1 产量下降 30 % 四项任一触发即淘汰。红线数据每 5 代更新一次，确保下游实验可重复。