细胞凋亡检测试剂盒的操作全流程

更新时间：2025-09-19

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　　细胞凋亡是机体维持稳态的关键机制——通过程序性细胞死亡清除受损或冗余细胞(如发育过程中的指间细胞、免疫系统的老化淋巴细胞)，其形态学特征(细胞皱缩、染色质凝聚、凋亡小体形成)与生化标志物(如磷脂酰丝氨酸PS外翻、Caspase酶激活)与坏死(细胞肿胀、膜破裂)截然不同。细胞凋亡检测试剂盒通过靶向这些特异性标志物，实现对凋亡程度的精准定量与定性分析，广泛应用于肿瘤研究、免疫学及药物毒性评估。

　　一、操作全流程：

　　1.样本制备：

　　•贴壁细胞：弃培养基，PBS轻洗2次，加入胰酶消化(无需全部解离，观察到细胞变圆即终止)，离心(1000rpm，5分钟，4℃)后PBS重悬，调整细胞密度至1×10⁶-1×10⁷cells/mL(悬浮细胞直接离心重悬)。

　　•组织样本：取新鲜组织(如脾脏、肿瘤，约0.1-0.3g)，剪碎后用胶原酶(1mg/mL)37℃消化30-60分钟(间歇震荡)，PBS过滤(40μm滤网)去除组织碎片，离心后重悬细胞。

　　2.检测方法选择与操作(以Annexin V-FITC/PI双染法为例，靶向PS外翻与膜完整性)：

　　•试剂孵育：将细胞悬液(100μL，约1×10⁵cells)加入离心管，依次加入5μL Annexin V-FITC(标记外翻的PS，早期凋亡标志)和5μL碘化丙啶(PI，标记坏死细胞或晚期凋亡细胞破裂的核DNA，终浓度约5μg/mL)，轻轻混匀，避光室温孵育15分钟(若检测Caspase酶活性，需提前30分钟加入Caspase底物探针)。

　　•上机检测：加入400μL 1×Binding Buffer(试剂盒配套，维持离子强度)，混匀后上流式细胞仪或荧光显微镜检测。

　　3.结果分析：

　　•流式细胞仪：横坐标为FITC(Annexin V)荧光强度(绿光)，纵坐标为PI荧光强度(红光)。四象限结果中：左下象限(Annexin V⁻/PI⁻)为正常细胞；右下象限(Annexin V⁺/PI⁻)为早期凋亡细胞(PS外翻但膜完整)；左上象限(Annexin V⁻/PI⁺)为坏死细胞(膜破裂)；右上象限(Annexin V⁺/PI⁺)为晚期凋亡细胞(PS外翻且膜破损)。凋亡率=(早期凋亡+晚期凋亡)细胞百分比。

　　•荧光显微镜：绿色荧光(Annexin V-FITC)标记早期凋亡细胞，红色荧光(PI)标记坏死细胞，叠加图像可直观观察不同状态细胞的比例。