HORAC检测的核心目标：量化抗氧化物质清除羟基自由基的能力

羟基自由基（·OH）是生物体内活性氧中反应活性较强的一种，易与脂质、蛋白质、DNA等生物大分子反应，引发氧化损伤。HORAC（Hydroxyl Radical Antioxidant Capacity）检测的核心目标，是通过科学方法量化样本（如食品、保健品、生物样本等）中抗氧化物质清除羟基自由基的能力，为评估样本的抗氧化活性提供可比较的量化指标。这一能力的测定，在食品品质评价、功能性成分筛选、临床抗氧化状态监测等领域具有实际应用价值。

HORAC检测的基本原理框架：基于氧化还原反应的竞争抑制法

HORAC检测的基本原理围绕“竞争抑制"展开：在体外反应体系中，羟基自由基会与特定探针发生氧化反应，生成具有可检测信号（如荧光、吸光度）的产物；当样本中存在抗氧化物质时，这些物质会与探针竞争羟基自由基，减少探针被氧化的程度，通过信号变化间接反映样本清除羟基自由基的能力。整个过程需控制反应条件（如温度、pH、反应时间），确保检测结果的稳定性和可重复性。

反应体系的构成：羟基自由基发生器、探针与样本的协同作用

HORAC检测的反应体系主要包含三个关键部分：

• 羟基自由基发生器：通常采用化学方法模拟体内羟基自由基的生成，常见体系如Fenton反应（Fe²⁺ + H₂O₂ → Fe³⁺ + ·OH + OH⁻），通过控制Fe²⁺和H₂O₂的浓度与比例，稳定生成羟基自由基。

• 探针：选择能被羟基自由基氧化且产物信号易检测的物质，荧光探针是常用类型。例如二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA），进入体系后被水解为DCFH（无荧光），DCFH被·OH氧化为DCF（强荧光物质），通过检测DCF的荧光强度变化反映·OH的生成量。

• 样本：待检测的抗氧化物质（如植物提取物、血清、食品溶液等），其浓度需通过预实验优化，确保在反应体系中处于线性响应范围内，避免浓度过高导致信号饱和或过低无法检测。

检测指标的获取：从信号变化到自由基清除率的计算

HORAC检测的核心是通过探针信号变化计算样本对羟基自由基的清除率，具体步骤包括：

1. 空白组与样本组设置：空白组（仅含自由基发生器和探针，无样本）用于反映未受抑制时的·OH生成量；样本组（含自由基发生器、探针和样本）反映样本存在时的·OH生成量。

2. 信号检测：在设定的激发波长（如485 nm）和发射波长（如535 nm）下，检测反应达到稳定后的荧光强度（以DCFH-DA为例，空白组荧光强度记为F₀，样本组记为Fₛ）。

3. 清除率计算：自由基清除率（%）= [(F₀ - Fₛ)/F₀] × 100%。清除率越高，表明样本清除羟基自由基的能力越强。

4. 标准化与定量：为便于不同样本间的比较，通常以Trolox（水溶性维生素E类似物）作为标准抗氧化物质，绘制清除率-浓度标准曲线，将样本的清除率转换为Trolox当量（如μmol Trolox/g样本），得到HORAC值。

原理的关键特性：特异性与灵敏度的保障

HORAC检测原理的可靠性依赖于对特异性和灵敏度的控制：

• 特异性：通过选择对羟基自由基高度专一的探针（如DCFH-DA对·OH的响应远强于超氧阴离子、过氧化氢等其他活性氧），减少非目标自由基的干扰；同时控制反应体系pH（通常弱酸性，如pH 7.4左右），避免其他氧化反应对结果的影响。

• 灵敏度：通过优化探针浓度、反应时间（如30分钟内完成反应，避免探针过度氧化）和仪器检测参数（如荧光分光光度计的狭缝宽度、增益），确保低浓度抗氧化物质也能产生可检测的信号变化，提升检测下限。