IgG4 操作使用手册：从复溶到功能验证的每一步

开箱验收：检查三件套

• 泡沫箱内层温度记录条 ≤ 8 °C 视为合格

• 干冰残留 ≥ 200 g 说明全程冷链未断

• 核对瓶身货号、批次与 COA 全一致，避免混发 IgG1 事件重演

复溶公式：别让粉末变絮状

• 冻干粉先回温 25 °C 十分钟，减少冷凝水吸入

• 按 1 mg 加 1 mL 无菌超纯水，沿壁缓慢注入，禁止涡旋

• 静置 15 min 后 1000 g 轻离 30 s，去掉气泡，浊度立即降到 0.05 AU

浓度核准：A280 与 RI 双通道

• 消光系数 1.39 (mg/mL)^-1cm^-1，直接读 A280 最省事

• 若含 5 % 蔗糖保护剂，RI 折射率偏移 0.0003，对应浓度虚高 2 %，用 SEC 脱糖后再测

• 最终浓度误差控制在 ±3 %，保证后续动物实验剂量可溯源

分装策略：单次用量决定管型

• 50 μL 小管适合 ELISA，杜绝反复吹打引入 IgG4 聚合

• 500 μL 螺旋盖用于细胞实验，O 型圈耐 -80 °C，防止冻裂

• 每管预留 10 % 死体积，避免化霜时吸不出造成批次内差异

冻融极限：聚合曲线告诉你

• 冻融 1 次，SEC 单体下降 0.2 %，肉眼不可见

• 第 3 次开始，二聚体以 0.4 %/次线性增加，第 5 次累计 2 %

• 功能实验里，二聚体每增加 1 %，FcγRI 结合信号下降 0.8 %，设定 3 次为红线

稀释缓冲液：pH 决定铰链柔性

• PBS 7.4 通用，但 IgG4 铰链在 6.0 更稳定，半衰期延长 15 %

• 做 Fab-arm exchange 研究时，换成 50 mM MES 6.0，可抑制自发交换

• 添加 0.05 % Tween-20 降低表面吸附，ELISA 背景直接降 30 %

动物注射：过滤步骤不可省

• 0.22 μm PVDF 低蛋白吸附膜，回收率 98 %

• 推注速度 1 mL/min，过快会导致尾静脉瞬时高压，IgG4 渗漏到皮下

• 留 20 μL 残液测内毒素，结果 ≤ 0.1 EU/mg 才写进实验记录

功能验证：交换反应阳参

• 将人 IgG4 与鼠 IgG2A 按 1:1 37 °C 孵育 24 h，HPLC 出现双特异峰说明交换成功

• 加入 5 mM 还原型谷胱甘肽，交换效率提升到 45 %，用作阳性对照

• 跑非还原 SDS-PAGE，150 kDa 条带消失，出现 75 kDa 杂合臂，即可判定体系正常

清洗维护：实验台也要防交叉

• 工作台先用 0.5 M NaCl 擦，再用 70 % 乙醇，盐离子先洗脱蛋白，酒精再灭活微生物

• 吸头盒专用 IgG4 标签，避免与 IgG1 混用，防止亚类干扰

• 每月做一次空白对照，PBS 代替样本走完整流程，背景 OD 450 上升 0.02 立即更换缓冲液批次