CCL4(MIP-1 beta) 技术参数全景图：从序列到功能的硬指标

1. 分子身份卡

• 符号：CCL4

• 别名：MIP-1β（Macrophage Inflammatory Protein-1 beta）

• UniProt ID：P13236

• 基因坐标：人类 17q12，小鼠 11D

• cDNA 长度：291 bp（编码区）

• pre-pro 肽：109 aa

• 成熟分泌肽：69 aa（剪切位点 Ala24-Leu25）

• 理论分子量：7.8 kDa（还原态 SDS-PAGE 实测约 8–10 kDa，糖基化后 11–13 kDa）

2. 三维结构参数

• 折叠模式：CC 趋化因子特征性 β1-β2-β3 三股反平行 β 片层，覆盖 C 端 α 螺旋

• 二硫键：Cys33-Cys75、Cys34-Cys58（绝对保守，决定构象稳定性）

• 寡聚态：生理浓度下倾向形成无活性同源二聚体；低 pH 或高盐条件解离为活性单体

• 受体结合面：N-loop（Glu26-His33）与 40s 区（Lys45-His49）共同构成 CCR5 结合热点，KD 2.3 nM（SPR 实测）

3. 表达谱与分泌动力学

• 主要源头：CD8⁺ T 细胞、巨噬细胞、NK 细胞、γδT 细胞、血小板

• 刺激窗口：TLR2/4/7 激动剂、IFN-γ、TCR 交联后 2 h 可见 mRNA 峰值，4–6 h 蛋白释放达 200–800 pg/10⁶ 细胞

• 半衰期：血清 15 min（小鼠），肺泡灌洗液 45 min；与糖胺聚糖结合后局部组织半衰期延长至 2 h

4. 生物活性定量

• 趋化指数：对 CCR5⁺ CD8⁺ T 细胞 1 nM 出现显著迁移，最大效应 10 nM（Transwell 体系）

• Ca²⁺ 流：CCR5-CHO 报告细胞，EC₅₀ 3.8 nM；信号持续 60–90 s

• HIV-1 抑制实验：实验室适应株 SF162，IC₉₀ 50 ng/mL（约 6.4 nM）

5. 批间一致性控制

• 内毒素：≤0.1 EU/μg（重组 E.coli 来源，LAL 法）

• 纯度：≥98 %（RP-HPLC，220 nm）；SDS-PAGE 单一条带；质谱验证分子量 ±0.1 %

• 生物比活：≥5×10⁵ U/mg（以人 CCR5⁺ T 细胞趋化实验标定，内部参考品校准）

6. 稳定性与存储

• 冻干品：4 °C 惰性气体封存，24 个月活性损失 <5 %

• 液体：PBS+0.1 % CHAPS，–80 °C 分装，避免反复冻融；3 次循环活性下降 8–12 %

• 温度敏感点：37 °C 放置 72 h 后单体比例下降 30 %，二聚体增加，趋化活性降低 15 %

7. 检测平台参数

• ELISA 灵敏度：2.4 pg/mL（R&D DuoSet），线性范围 7.8–500 pg/mL

• Luminex 多因子：Milliplex MAP，交叉反应 <0.5 %，与 CCL3、CCL5 无串扰

• 单细胞分泌：微孔编码芯片（Isoplexis），检测阈值 0.8 分子/小时/细胞

8. 工程改造热点

• L3K突变：破坏二聚界面，单体化后趋化活性提高 2.3 倍，血清半衰期缩短 40 %

• C-terminal PEG5k：体内 t½ 延长至 3 h，HIV 抑制 IC₉₀ 降低 5 倍，但趋化活性下降 30 %

• [R47A] 变体：保留 CCR5 拮抗能力，消除募集 T 细胞副作用，用于 HIV 进入抑制剂开发

9. 与受体相互作用的晶体学坐标

• PDB 条目：5UIW（CCL4-CCR5 复合物），分辨率 2.9 Å

• 界面面积：1,140 Ų，氢键 8 对，盐桥 3 对；水介导相互作用 4 处

• 热点残基：Asn22、Arg47、Glu66 突变后结合自由能变化 ΔΔG >3 kcal/mol

10. 实验设计常用浓度窗口

• 体外趋化：梯度 0.1–100 nM，最佳 10 nM

• 小鼠腹腔炎模型：单次 500 ng/200 μL，4 h 后巨噬细胞浸润峰值 1.2×10⁶ 细胞/mL

• HIV 挑战：预处理 100 ng/mL，30 min 后病毒加入，保护率 >90 %（R5 毒株）