DPPIV/CD26 技术参数拆解：把“酶活-荧光-流式”三个维度一次对齐

1. 酶活单位定义：FCCU、IU、RFU 先换算再比较

• 供应商 A 用 FCCU（Fluorogenic Chromogenic Unit），供应商 B 用 IU（International Unit），两者差 3.2 倍。

• 统一换算成 RFU·min⁻¹·μg⁻¹ 最直观：以 Gly-Pro-AMC 为底物，50 μl 体系、100 μM 底物、37 °C，激发 380 nm/发射 460 nm，斜率 ÷ 蛋白量即可。

• 合格重组人 DPPIV 应 ≥ 1200 RFU·min⁻¹·μg⁻¹，低于 800 的直接退货，通常是跨膜域切除不完整，催化口袋柔性下降。

2. 比活性与纯度脱钩：SDS-PAGE 98 % 也不够

• 比活性 1200 RFU·min⁻¹·μg⁻¹ 是硬门槛，纯度 98 % 只是入门。

• 剩余 2 % 杂蛋白若含羧肽酶 M，会把 AMC 荧光本底抬高 15 %，导致酶活虚高。

• 要求 COA 附带 羧肽酶抑制实验：加入 10 μM 卡托普利，荧光斜率下降 < 5 %，才承认是“纯 DPPIV 信号"。

3. 荧光底物选择：AMC、R110、AFC 谁更抗光淬

• AMC 便宜但半衰期 30 min，长时间动力学实验光淬明显，RFU 线性期只有前 8 min。

• R110（Gly-Pro-R110）量子产额高，线性期 25 min，适合 96 孔高通量，但价格 ×3。

• AFC 激发 400 nm，与细胞自发荧光重叠少，适合活细胞实时监测，发射 505 nm 避开黄素波段，信背比提升 40 %。

4. 流式抗体参数：BV421 vs FITC 亮度差 5 倍

• CD26-FITC 标记指数（Stain Index）≈ 6，BV421 可达 30，低表达细胞群区分度瞬间拉高。

• 但 BV421 激光 405 nm，要求机器 violet laser 功率 ≥ 50 mW，老型号 BD Calibur 直接出局。

• 抗体用量 FITC 按 5 μl/10⁶ 细胞，BV421 只需 1 μl，节省 80 % 成本，高表达 Jurkat 可再降半量。

5. 温度系数：37 °C 与 25 °C 差 1.7 倍

• 酶活随温度升高呈 S 型曲线，25 °C 到 37 °C 斜率 1.7，超过 42 °C 迅速失活，半衰期 3 min。

• 高通量筛选想做室温避光，必须把 cut-off 值按 1.7 倍修正，否则假阳性率 30 %。

• incubator 内读板器要校准，实测孔间温差 ±0.5 °C 就能让 Z-factor 从 0.8 掉到 0.5。

6. 金属离子干扰：Mg²⁺ 激活，Zn²⁺ 抑制

• 5 mM MgCl₂ 能把 kcat 提升 22 %，因为稳定催化三联体 His740-Asp708-Ser630 构象。

• 1 μM ZnSO₄ 就能抑制 50 % 活性，Zn²⁺ 与 His740 配位阻断电荷中继，老批次 PBS 若用镀锌桶分装，背景会莫名升高。

• 自己配缓冲液用 塑料桶+RO 水+螯合树脂，ICP-MS 测 Zn²⁺ < 10 ppb，才能保证批次重现。

7. 储存稳定度：−80 °C 6 个月，液氮反而裂解

• 酶液加 20 % 甘油 −80 °C 保存，6 个月活性零损失；直接投液氮，玻璃化应力让蛋白局部变性，比活性掉 15 %。

• 分装体积 50 μl，冻融一次用完，二次冻融聚体率 8 %，三次直接 20 %，Native-PAGE 出现 220 kDa 寡聚峰。

8. 校准颗粒：用“酶活-荧光"双标微球做日检

• Bangs Laboratories 的 CD26-Active Beads，把已知酶活 500 RFU·min⁻¹ 共价固定在微球表面，每天跑 10³ 颗粒，FL1 通道荧光强度漂移 > 10 % 就重新标定 PMT。

• 比用可溶性标准品省 50 % 成本，还顺带把流式机状态一起监控，一张票干两件事。