IL-17F 实验攻略：把易降解的“同型二聚体”做出可重复数据

1. 融化节奏：15 °C 水浴 + 200 rpm 震荡

• 37 °C 速融会让 IL-17F 在 30 s 内局部升温至 40 °C，疏水核心暴露，聚体率瞬间飙到 18 %。

• 改用 15 °C 循环水浴，搭配小型旋涡震荡器 200 rpm，90 s 全融化，聚体率 < 3 %，活性回收率 97 %。

• 融化后立刻转移到冰上，任何室温静置 > 5 min 都会让末端 His 标签脱落，Western blot 出现 13 kDa 杂带。

2. 稀释公式：先“高浓母液"再“阶梯降盐"

• IL-17F 在 < 50 μg/ml 时极易吸附管壁，0.1 % BSA 只能救一半。

• 第一步用 原倍缓冲液（PBS+300 mM NaCl） 配成 500 μg/ml 母液，高离子强度屏蔽疏水面，吸附率 < 1 %。

• 第二步再用 低盐工作液（PBS+0.1 % 海藻糖） 稀释到 50 ng/ml，阶梯降盐让蛋白结构逐步松弛，避免瞬间脱盐导致的β-折叠错位。

3. 储存容器：低吸附管只是入场券

• 品牌之间差异巨大：某进口低吸附管 2 h 损失 8 %，国产某款损失 22 %。

• 实测 聚丙烯+硅化涂层+琥珀色避光 组合 24 h 损失 3 %，价格只贵 15 %，长期实验更划算。

• 管盖密封圈必须二次压紧，IL-17F 含两对游离巯基，长期接触空气会生成错配二聚体，非还原胶多出 30 kDa 条带。

4. 冻存密度：0.5 ml/管 是红线

• 1 ml 装液量中心降温速率慢，形成大冰晶，一次冻融活性掉 25 %。

• 0.5 ml 液体厚度 4 mm，−80 °C 降温速率 ≈ 25 °C/min，冰晶尺寸 < 50 nm，蛋白结构应力最小。

• 每管写好 日期+批号+浓度，避免反复核对，−80 °C 开门时间缩短 10 s，箱内温度波动 < 1 °C。

5. 实验前“热身"：37 °C 复温 3 min 足够

• 某些 protocol 写 37 °C 5 min，实测 3 min 与 5 min 活性无差异，后者聚体率反而高 2 %。

• 复温后立即涡旋 2 s，让可能存在的浓度梯度瞬间均一，再冰上静置 1 min，体系温度降至 10 °C 以下，加入细胞孔板时不会引起局部热休克。

6. 污染排查：内毒素比菌体更致命

• IL-17F 本身无抗菌域，0.25 EU/ml 的内毒素就能让 HCT-8 细胞分泌 IL-8 背景飙 5 倍，直接把 EC50 抬高一个数量级。

• 每批次做 LAL 显色法 复检，> 0.1 EU/μg 直接退货；自己再过滤除菌一次，活性会掉 10 %，得不偿失。

7. 数据对标：磷酸化 STAT3 才是硬指标

• 用 IL-6 做正对照，IL-17F 100 ng/ml 刺激 HeLa 30 min，p-STAT3 信号应达到 IL-6 的 60–70 %。

• 低于 50 % 说明批次活性不足，高于 90 % 提示有 IL-17A 污染，需做 pIEF 等电聚焦 验证，IL-17F 理论 pI 7.8，IL-17A 5.6，两条带即可判定混批。