谷胱甘肽(GSH)是细胞内较重要的非酶抗氧化剂，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成(γ-谷氨酰-半胱氨酰-甘氨酸)，通过提供还原性巯基(-SH)直接中和自由基(如过氧自由基ROO·)，并参与维持细胞氧化还原平衡(如协助维生素C/E再生)。GSH检测试剂盒通过特异性检测还原型GSH(rGSH，具有生物活性)或总GSH(tGSH，rGSH+氧化型GSH=GSSG)，成为研究氧化应激、药物毒性及营养干预效果的关键工具。
一、样本制备：
•血液样本：全血需立即加入抗坏血酸(1%final浓度)或DTT(二硫苏糖醇，5mM)作为还原剂，防止红细胞破裂后释放的GSH被空气氧化为GSSG；血清样本因不含细胞，可直接离心(3000rpm，10分钟)取上清，但需在采血后30分钟内处理(避免血清中残余血小板释放GSH)。
•组织样本：取新鲜组织(如肝脏、肾脏，约0.1-0.5g)，迅速剪碎后加入预冷的PBS缓冲液(pH 7.4，含1mM EDTA抑制金属离子催化氧化)，均质化后离心(12000rpm，15分钟，4℃)，取上清液(total protein浓度建议1-5mg/mL)；若检测tGSH，需额外加入N-乙基马来酰亚胺(NEM，10mM)封闭游离巯基，防止体外氧化。
•细胞样本：贴壁细胞用PBS轻洗2次，加入PBS(含1mM EDTA)刮取或用胰酶消化后离心(1000rpm，5分钟，4℃)，PBS重悬后再次离心，弃上清后加入裂解液(含5mM DTT)，冰上孵育10分钟裂解，超声波破碎(功率20%，30秒×3次)，离心(15000rpm，10分钟，4℃)取上清。
二、试剂配制：
试剂盒通常包含衍生化试剂(如DTNB，5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，与GSH反应生成黄色2-硝基-5-硫代-2-硝基苯甲酸，5-硫代-2-硝基苯甲酸在412nm有吸收峰)、反应缓冲液(维持pH 8.0-8.5，促进反应)、标准品(已知浓度GSH，如0-100μM梯度)及封闭剂(如NEM)。使用时需现配现用——DTNB溶液避光保存(棕色瓶，4℃可存1周)，缓冲液用去离子水新鲜配制(避免金属离子干扰)，标准品用PBS稀释至工作浓度(如1-10μM，每点间隔2μM)。
三、数据处理：
•计算rGSH/tGSH浓度：根据标准曲线(吸光度值vs.GSH浓度，线性范围通常0-10μM，R²≥0.99)，将样本吸光度代入回归方程，得到样本中GSH浓度(μM)；若检测tGSH(含GSSG)，需先用2-乙烯吡啶(VP)将GSSG转化为rGSH(反应15分钟)，再检测总活性，通过差值计算GSSG含量(tGSH=rGSH+GSSG)。
•标准化到蛋白量/组织量：结果通常表示为nmol GSH/mg蛋白(用BCA法测定样本总蛋白浓度)或μmol GSH/g组织(用于整体样本分析)，避免因取样量差异导致数据不可比。
•注意事项：若样本吸光度超出标准曲线范围，需稀释后重新检测；空白对照(试剂+缓冲液，无样本)的吸光度应<0.05(排除试剂本底干扰)；重复检测3次取平均值(CV值≤10%为可靠数据)。
掌握GSH检测试剂盒的操作要点，不仅能精准量化细胞或组织的抗氧化储备(如肝组织rGSH正常含量约2-5nmol/mg蛋白)，更能为氧化应激相关疾病的机制研究与干预策略提供可靠数据支撑。
更新时间：2025-09-16
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