TGF-β1 ELISA 实测误差 90% 来自活化：把 LAP 剪干净再测

1. 行业标准里找不到的“隐标准"：活性 vs 总蛋白

药典和 ISO 对 TGF-β1 ELISA 只规定灵敏度、回收率、批间 CV，却不区分“总 TGF-β1"与“活性 TGF-β1"。实验室拿到的血清样本 95% 以上是潜伏复合体（LAP-TGF-β1），试剂盒抗体若识别 LAP 区，结果比真正活性形式高 5–20 倍。投稿时审稿人一句“数据过度估计"直接打回。先把样本酸化-中和流程跑通，再谈灵敏度。

2. 酸化-中和：0.2 M HCl 只给 10 min，超时反而掉信号

潜伏复合体在 pH 2.0 以下 5 min 即可解离，延长到 30 min 会让 TGF-β1 表位不可逆折叠，后续抗体结合率掉 30%。标准操作：每 100 μL 样本加 20 μL 0.2 M HCl，室温 10 min，立即加 20 μL 0.2 M NaOH 中和，PBS 补足到原体积。用精密 pH 试纸点检，落在 7.2–7.4 才能上桌。血清含缓冲能力高的高脂样本，中和后回测 pH 仍低于 7.0，补 1 M Tris 2 μL 微调，否则板底出现絮状沉淀，OD 直接爆表。

3. 肝素血浆的“蓝屏"事件：负峰来自 LAP 片段

肝素激活血浆中脂蛋白脂肪酶，剪切 LAP 产生 25 kDa 小片段，该片段与捕获抗体交叉结合，却失去信号放大能力，导致 15–40% 负偏差。EDTA 血浆不存在该问题，但 EDTA 浓度高于 5 mM 会螯合板底包被的 Ca²⁺，抗体取向变差。折中方案：采血用 1.8 mg/mL EDTA-K₂，离心后 1:2 稀释再上板，既抑制金属蛋白酶，又把 EDTA 浓度降到 1 mM 以下。

4. 校准品稀释液：别用 PBS-Tween 凑合

TGF-β1 在 0.05% Tween-20 里 4 °C 存放 24 h 损失 18%，因为疏水表位暴露后聚合。厂家原装稀释液含 0.1% CHAPS + 0.5 M 精氨酸，能把聚合率压到 5% 以内。实验室自己稀释校准品，用 PBS + 0.1% BSA 替代，曲线低端直接掉 30%，灵敏度从 4.6 pg/mL 变成 15 pg/mL。买试剂盒时让供应商多给 50 mL 专用稀释液，成本不到 80 元，比重做一条曲线便宜。

5. 板温育：2–8 °C 过夜 vs 37 °C 1 h 差异藏在斜率里

说明书常给两种方案：4 °C 过夜或 37 °C 1 h。看上去只是时间换温度，实则动力学不同。4 °C 方案抗体亲和力高，低端信号抬升，曲线斜率 1.4；37 °C 方案反应快，斜率 1.2。做药代动力学样本，浓度跨度 4 个数量级，用 4 °C 过夜能把 LLOQ 推到 1.5 pg/mL，但高值 10 ng/mL 会超出平台，必须 1:100 稀释。选哪种方案，先把样本最高值跑一遍，再决定曲线范围，否则高点落在平台区，CV 直接飙到 20%。

6. 背景 OD 0.08 以上，先查洗板机管道

TGF-β1 检测常用链霉亲和素-生物素放大，背景 OD 超过 0.08 基本来自洗板机针口残留。拆下 8 道洗头，用 1% 次氯酸钠浸泡 15 min，再用纯水反冲，背景能降到 0.03。管道老化洗不干净，表现为第 1 列背景高、第 12 列正常，换一根管道成本 120 元，比反复验证抗体划算。

7. 回收率试验：加标浓度别用校准品溶液

校准品含 CHAPS 与精氨酸，基质比真实样本干净，加标回收常虚高 110–120%。用混合血清做溶剂，先把内源 TGF-β1 酸化灭活，中和后当阴性基质，再加校准品配 15、60、240 pg/mL 三水平，回收率落在 85–115% 才算通过。实验室跳过灭活步骤，内源活性没被抑制，结果出现“超回收"140%，文章投稿被质疑造假。

8. 数据报告：活性浓度单位用 pg/mL，别换算成 mol

TGF-β1 分子量 25 kDa，1 pg/mL ≈ 0.04 pM，期刊要求用摩尔浓度，看似规范，实则把误差放大。ELISA 检测的是免疫活性，不是质量浓度，换算后读者误以为能与其他实验室质谱数据横向比较。直接在正文标注“pg/mL of active TGF-β1 (acid-activated)"，审稿人反而认可。