细胞毒性检测试剂盒（乳酸脱氢酶法）：精准评估细胞损伤的可靠工具

一、乳酸脱氢酶法的原理

乳酸脱氢酶（LDH）是一种广泛存在于各种细胞中的稳定酶，正常情况下，细胞膜的完整性能够防止 LDH 泄漏到细胞外。然而，当细胞受到毒性物质的损伤、发生凋亡或坏死导致细胞膜破损时，LDH 会迅速释放到细胞培养基中。细胞毒性检测试剂盒（乳酸脱氢酶法）正是基于这一原理，通过检测细胞培养基中 LDH 的活性来定量评估细胞膜损伤程度以及细胞毒性。

LDH 在细胞内的浓度相对稳定，且在细胞受损后释放迅速，这使得它成为检测细胞毒性和细胞死亡的理想标志物。该方法具有高度的灵敏性和特异性，能够准确反映细胞受损的情况，且不受细胞种类和培养条件的显著影响。

二、试剂盒的组成与操作流程

试剂盒的组成

细胞毒性检测试剂盒（乳酸脱氢酶法）主要包含以下几种关键组分：

• LDH 检测试剂：含有特定的底物和辅助因子，能够与 LDH 发生反应，生成可检测的产物。在反应过程中，LDH 催化乳酸和 NAD⁺ 氧化生成丙酮酸和 NADH，随后通过一系列反应生成可被比色或荧光检测的产物。

• 反应缓冲液：提供一个适宜的反应环境，确保 LDH 酶活性的稳定发挥，同时保证反应的特异性和灵敏度。其成分经过精心优化，以消除其他因素对检测结果的干扰。

操作流程

细胞培养与处理

根据实验需求，将细胞接种于适当的培养容器中，并进行相应的处理，如添加待测药物、化学物质或其他刺激因素。设置多个重复孔以提高实验数据的可靠性。将培养容器置于细胞培养箱中，在适宜的温度（一般为 37℃）、湿度和二氧化碳浓度（通常为 5%）条件下孵育细胞，使细胞充分接触处理因素并产生相应的反应。

收集培养上清液

孵育结束后，轻轻吸出培养孔中的上清液，注意避免对细胞造成机械损伤。将收集到的上清液置于冰上或 4℃保存，以防止 LDH 的降解或失活。上清液中释放的 LDH 活性与细胞膜受损的细胞数量成正比，是评估细胞毒性的关键样本。

加入检测试剂并孵育

将收集到的上清液转移至新的反应孔中，按照试剂盒说明书的要求加入适量的 LDH 检测试剂和反应缓冲液。轻轻混匀后，在室温下避光孵育一定时间，通常为 15 - 30 分钟。孵育过程中，LDH 与检测试剂发生反应生成可检测的产物。

比色测定与结果分析

使用酶标仪在特定波长下（一般为 490 - 500 nm）测量反应孔中的吸光度值。根据标准曲线或已知浓度的 LDH 样品，计算出样本中 LDH 的活性或浓度。LDH 活性越高，表明细胞膜受损的细胞数量越多，细胞毒性越强。通过比较处理组与对照组的 LDH 活性，可以定量评估待测物质的细胞毒性。

三、应用实例与优势

应用实例

药物毒性筛选

在药物研发过程中，细胞毒性检测试剂盒（乳酸脱氢酶法）被广泛用于筛选化合物的细胞毒性。通过测定不同浓度药物处理后的细胞培养上清液中的 LDH 活性，可以确定药物的半数抑制浓度（IC₅₀），从而评估药物的潜在毒性。这有助于在药物研发的早期阶段排除具有高毒性的候选化合物，提高药物研发的成功率。

化学物质毒性评估

对于环境化学物质、食品添加剂等的毒性评估，该试剂盒提供了一种快速、灵敏的检测手段。能够快速评估这些化学物质对细胞的潜在危害，为食品安全和环境保护提供科学依据。

优势分析

• 灵敏度高：LDH 法对细胞毒性变化的检测非常灵敏，能够检测到少量细胞受损释放的 LDH，适用于各种细胞类型和不同毒性程度的检测。即使是低水平的细胞膜损伤，也能通过 LDH 活性的变化准确反映出来，这对于早期毒性评估和低毒性化合物的筛选具有重要意义。

• 特异性强：LDH 作为细胞内的稳定酶，其释放主要与细胞膜损伤相关，因此 LDH 法具有较高的特异性。与其他细胞毒性检测方法（如基于代谢活性的 MTT 法）相比，LDH 法不受细胞代谢状态变化的影响，能够更准确地反映细胞膜的完整性损伤，避免了因细胞代谢差异导致的假阳性或假阴性结果。

• 操作简便：该试剂盒的操作流程简单易行，无需复杂的仪器设备和特殊的技术要求。仅需常规的细胞培养设备和酶标仪，即可完成从细胞处理到结果检测的全过程。这使得该方法易于在不同实验室之间推广和应用，特别适合高通量筛选和大规模实验。

• 稳定性好：LDH 在细胞培养基中相对稳定，能够在较长时间内保持活性。这使得样本的收集和检测可以灵活安排，无需严格精确的时间控制，为实验操作提供了更大的便利性。同时，试剂盒的组成成分稳定性高，保存时间长，有利于实验的连续开展和重复性验证。

四、注意事项与质量控制

注意事项

• 避免样本污染：在操作过程中，应严格遵循无菌操作原则，避免样本受到微生物污染。污染可能会影响 LDH 的活性检测结果，导致数据偏差。使用无菌的试剂、耗材和培养容器，并在超净工作台中进行操作。

• 控制实验条件：实验条件的一致性对于准确评估细胞毒性至关重要。包括细胞密度、处理时间、温度、湿度和二氧化碳浓度等，都应保持稳定。细胞密度过高或过低可能影响检测灵敏度；处理时间的差异可能导致 LDH 释放量的不同；温度和气体条件的变化会影响细胞的代谢和酶活性。

• 及时检测：收集到的培养上清液应尽快进行检测，以防止 LDH 的降解或失活。若不能立即检测，应将样本置于冰上或 4℃短期保存（不超过 6 小时），对于长期保存（超过 6 小时），建议将样本置于 -20℃或 -80℃冷冻保存，但需注意避免反复冻融，以免影响 LDH 活性。反复冻融会使 LDH 发生变性，导致活性降低，影响检测结果的准确性。

• 避免溶血和细胞碎片干扰：在收集培养上清液时，应轻柔操作，避免剧烈振荡或机械损伤细胞，以防溶血和细胞碎片释放 LDH，从而干扰检测结果。溶血会使大量 LDH 从红细胞中释放，导致检测结果偏高；细胞碎片中的 LDH 也可能被误判为细胞毒性释放的 LDH，影响对实际细胞膜损伤程度的准确评估。

质量控制

• 设置对照：每次实验都应设置适当的对照组，包括空白对照（仅含培养基）、阴性对照（未处理的正常细胞）和阳性对照（使用已知毒性物质处理的细胞）。通过比较不同组别的 LDH 活性，可以验证实验的可靠性和准确性，同时排除实验中可能出现的非特异性干扰因素。空白对照用于校准酶标仪的背景吸光度；阴性对照反映正常细胞的 LDH 本底水平；阳性对照用于评估实验系统的灵敏度和检测限。

• 重复实验：为了确保数据的可靠性，建议进行多次独立重复实验。统计学分析可帮助评估数据的离散性和变异性，如计算平均值、标准差、标准误以及进行 t 检验等。多次重复实验的结果一致性高，表明实验数据具有较高的可信度。

• 使用标准品：试剂盒通常提供 LDH 标准品，用于建立标准曲线。在每次实验中，应同时测定标准品的吸光度值，并绘制标准曲线。通过标准曲线可以准确计算样本中 LDH 的活性或浓度，消除实验间差异和试剂批次间的影响，确保不同实验结果之间的可比性。