细胞增殖与毒性检测的得力工具：CCK-8 法

在细胞生物学和生物医学研究中，细胞增殖和毒性检测是评估细胞健康状态、药物效果及化学物质生物活性的关键实验技术。细胞增殖 / 毒性检测试剂盒（CCK-8 法）凭借其简便、灵敏、高效的特点，已成为科研工作者手中的得力工具。

一、CCK-8 法的原理

CCK-8 法的核心在于使用一种名为 WST-8 的高度水溶性四唑盐。在具有活性的活细胞内，WST-8 能够在电子介体的协助下，被细胞中的脱氢酶还原生成橙色的水溶性甲瓒产物。这一反应产生的颜色变化可以通过比色测定进行量化，且生成的甲瓒产物量与活细胞数量呈正相关。基于这一原理，CCK-8 法能够实现对细胞增殖情况的精准检测和对细胞毒性实验的灵敏评估。

二、CCK-8 法的优势

高灵敏度

CCK-8 试剂盒的检测灵敏度高于其他常见的四唑盐，例如 MTT、XTT、MTS 或 WST-1。这意味着在低细胞密度或细胞增殖缓慢的情况下，CCK-8 法仍能提供可靠的检测结果。这使得研究人员能够在更广泛的实验条件下进行细胞增殖和毒性检测，尤其适用于那些对灵敏度要求较高的实验场景。

操作简便

CCK-8 法的操作流程简单快捷，无需复杂的设备或繁琐的步骤。仅需将 CCK-8 溶液加入到含有细胞的培养孔中，经过一定时间的孵育后，直接使用普通酶标仪在 450 nm 波长处测量吸光度即可。这种简便性使得实验过程更加高效，减少了实验操作时间和潜在的误差来源。

水溶性与稳定性

WST-8 的水溶性特性避免了传统四唑盐（如 MTT）在使用过程中产生的沉淀问题，使得反应更加均匀，测量结果更加稳定可靠。同时，CCK-8 试剂盒的组分在常温下相对稳定，便于保存和反复使用。

非放射性

CCK-8 法是一种非放射性检测方法，相较于放射性同位素标记的检测手段，它更加安全、环保，降低了实验操作的风险，并且减少了对特殊设备和许可的依赖。

三、CCK-8 法的操作步骤

细胞准备

根据实验目的选择合适的细胞类型，并将其培养至适当的密度。对于贴壁细胞，使用胰蛋白酶消化并收集细胞；对于悬浮细胞，直接收集即可。然后用相应的培养基将细胞稀释至适当的浓度，通常为每毫升 5×10³ 至 1×10⁵ 个细胞。

染色过程

将细胞悬液接种于 96 孔板中，每孔 100 μL。设置空白孔（仅含培养基）、阴性对照孔（仅含细胞和培养基）和实验孔（含细胞、培养基和待测药物或刺激物）。每组设置至少三个复孔以确保数据的可靠性。将 96 孔板置于细胞培养箱中，37℃、5% CO₂条件下孵育一段时间，使细胞贴壁或让药物作用于细胞。

加入 CCK-8 试剂

按照试剂盒说明书的要求，向每孔加入 10 μL CCK-8 溶液。继续将 96 孔板置于细胞培养箱中孵育 1 - 4 小时。孵育时间应根据细胞类型和实验需求进行优化，以确保充分的反应时间，使 WST-8 还原为甲瓒产物。

测量吸光度

孵育完成后，将 96 孔板置于酶标仪上，使用 450 nm 波长测量各孔的吸光度值。若酶标仪带有 630 nm 的滤光片，可进行双波长测定，以扣除背景吸光度，提高检测的准确性。

四、CCK-8 法的应用实例

药物筛选与细胞毒性评估

CCK-8 法在药物研发领域具有重要应用，可用于筛选和评估药物的细胞毒性。通过将不同浓度的药物与细胞共孵育，然后使用 CCK-8 法检测细胞存活率，可以确定药物的半数抑制浓度（IC₅₀），从而评估药物的潜在毒性和治疗窗口。这为新药研发过程中的药物安全性评价提供了重要的数据支持。

细胞增殖研究

在细胞生物学研究中，CCK-8 法广泛用于研究细胞的增殖特性。例如，通过检测不同时间点细胞的 CCK-8 吸光度值，可以绘制细胞增殖曲线，了解细胞在不同培养条件下的生长动力学。这对于优化细胞培养条件、研究细胞周期调控以及探究细胞信号转导通路具有重要意义。

细胞凋亡与存活分析

除了增殖和毒性检测，CCK-8 法还可以与其他检测方法联合使用，以获得更全面的细胞状态信息。例如，将 CCK-8 法与 Annexin V/PI 双染法结合，可以同时检测细胞的增殖情况和凋亡率，从而更准确地评估细胞的生理状态和实验处理的影响。

五、注意事项与质量控制

细胞状态监测

在实验过程中，定期观察细胞的生长状态和形态变化，确保细胞处于良好的生理状态。若发现细胞出现异常，如形态改变、生长缓慢或颜色异常，应及时调整实验条件，可能是培养基营养不足、细胞受到污染或药物浓度过高等原因导致的。

避光操作

CCK-8 试剂和生成的甲瓒产物对光敏感，操作过程中应尽量减少样本的光照时间，以防止光漂白或光降解影响检测结果的准确性。在加入 CCK-8 试剂后，应避免将 96 孔板暴露在强光下，并尽快进行孵育和测量。

试剂质量控制

确保所使用的 CCK-8 试剂盒质量合格，保存条件符合要求。试剂盒应保存在 4℃左右的低温环境中，避免光照直射和温度波动过大。在保存过程中，注意密封保存，防止试剂挥发或吸收水分。使用前应仔细检查试剂是否变色、沉淀或过期，如有异常则不宜使用。

实验重复与数据验证

为了确保实验结果的可靠性和可重复性，建议进行多次独立实验，并设置适当的重复孔数。对实验数据进行统计学分析，计算平均值、标准差和标准误等指标，以评估数据的离散性和显著性。若实验结果出现较大的变异系数或不符合预期，应仔细检查实验操作过程，排除可能的误差来源，重新进行实验。