DiO (DiOC18(3))：绿色荧光标记与细胞膜示踪的高效工具

在细胞生物学研究中，对细胞膜进行荧光标记和示踪是观察细胞行为、分析细胞相互作用以及研究细胞迁移和分布的重要手段。DiO (DiOC18(3))作为一种绿色荧光的亲脂性膜染料，凭借其染色机制和优异的性能，成为细胞膜标记领域的理想选择。

一、DiO 的染色机制与特性

DiO 是一种亲脂性羰花青染料，其在水溶液中荧光较弱，但当嵌入细胞膜后，其荧光强度显著增强，同时光稳定性也得到显著提升。这种荧光增强效应归因于 DiO 分子与细胞膜脂质双层的相互作用。DiO 分子具有疏水性，能够自发地插入到细胞膜的脂质双层中，并沿着膜平面进行侧向扩散。随着 DiO 分子在细胞膜中的逐渐扩散，整个细胞膜会被均匀染色，发出明亮的绿色荧光。

DiO 的荧光信号稳定，不易受到光漂白的影响，这使得它在长时间的观察和检测中表现出色。此外，DiO 对细胞的毒性极低，通常不会影响细胞的正常生理功能和生存力，适用于活细胞的长期示踪和观察。

二、DiO 的应用领域

细胞膜标记

DiO 最常见的应用是对细胞膜进行标记，以观察细胞的形态和行为。在细胞标记实验中，将细胞与 DiO 染色液混合孵育，DiO 分子会迅速插入到细胞膜中并发出荧光。通过荧光显微镜可以清晰地观察到细胞膜的轮廓和形态变化。

DiO 标记的细胞膜荧光信号均匀且稳定，能够长时间保持荧光强度，适用于多种细胞类型，包括贴壁细胞和悬浮细胞。标记后的细胞可以用于后续的细胞培养、细胞迁移实验和细胞相互作用研究等。

细胞示踪

DiO 被广泛用于细胞示踪实验，特别是在神经科学领域。它可以作为正向或逆向的示踪剂，用于标记和追踪神经元及其突起。在神经组织切片或活体动物模型中，DiO 标记的神经元可以通过荧光成像技术进行长期观察，揭示神经元的连接模式、信号传导路径以及神经网络的动态变化。

此外，DiO 还可以用于标记和追踪其他类型的细胞，如免疫细胞、干细胞和肿瘤细胞等。在体内实验中，DiO 标记的细胞可以通过荧光成像技术实时观察其在生物体内的分布、迁移和存活情况，为细胞治疗、组织工程和肿瘤转移等研究提供重要数据支持。

三、DiO 的操作使用方法

染色前准备

在进行 DiO 染色之前，需要准备好细胞样本。对于贴壁细胞，可以使用胰蛋白酶消化收集细胞，然后用适当的缓冲液洗涤细胞，去除残留的培养基成分。对于悬浮细胞，直接收集细胞并进行洗涤。将细胞调整到合适的浓度，一般为 1×10^5 - 1×10^6 cells/mL，以便于后续的染色和检测。

染色过程

将准备好的细胞与 DiO 染色液混合，DiO 的常用工作浓度为 5 - 20 μM。将混合后的细胞悬液置于 37℃、5% CO₂ 的细胞培养箱中孵育 5 - 30 分钟。在孵育过程中，DiO 分子会插入到细胞膜中，产生绿色荧光。孵育时间可根据细胞类型和实验需求进行优化，以获得最佳的染色效果。

染色后处理

孵育完成后，用 PBS 轻轻洗涤细胞两次，去除未结合的染料。对于需要进行细胞膜标记观察的样本，将标记后的细胞接种到培养皿或培养板中，加入适量的培养基，放入细胞培养箱中进行培养。对于需要进行细胞示踪实验的样本，将标记后的细胞用于后续的体内或体外实验。使用荧光显微镜进行观察时，设置 488 nm 的激发波长和 500 - 550 nm 的发射波长检测通道，收集绿色荧光信号，实现对细胞膜的标记和示踪。

四、DiO 的优势与注意事项

优势

• 低细胞毒性：DiO 对细胞的毒性极低，不会显著影响细胞的正常生理功能，适用于长期的细胞培养和实验观察。

• 良好的细胞膜通透性：DiO 能够快速穿透细胞膜并插入到脂质双层中，实现对细胞膜的标记。

• 稳定的荧光信号：DiO 嵌入细胞膜后，荧光信号稳定，不易受到光漂白的影响，适合长时间的荧光观察和检测。

• 多色荧光标记：DiO 发出绿色荧光，可与其他发出不同颜色荧光的染料（如 DiI、DiR）联合使用，实现多色荧光标记，为复杂生物过程的研究提供了更全面的视角。

注意事项

• 染色浓度优化：使用 DiO 时，需根据细胞类型和实验需求优化染色浓度。浓度过高可能导致细胞膜过度染色或细胞毒性增加，而浓度过低则可能使荧光信号不足。

• 避光操作：DiO 染料对光敏感，操作过程中应尽量减少样本的光照时间，以防止荧光淬灭。

• 背景荧光控制：在染色过程中，需确保染色步骤的规范性，以减少背景荧光。例如，孵育后应充分洗涤细胞，去除未结合的染料。

• 保存条件：DiO 染料应密封保存于干燥、避光的环境中，避免接触强光和高温，以保持其活性和稳定性。