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技术文章
更新时间：2025-05-07
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在细胞生物学研究中，对活细胞进行荧光标记和染色是观察细胞生理状态、检测细胞活性以及分析细胞群体中活死细胞比例的重要手段。Calcein AM作为一种低细胞毒性的荧光染料，为这些研究提供了一种高效且可靠的解决方案。
Calcein AM是一种常用的活细胞荧光标记试剂，其激发波长为490 nm，发射波长为515 nm，属于绿色荧光范围。该染料能够穿透活细胞的细胞膜进入细胞内部，在细胞内由酯酶剪切，转化为具有强绿色荧光的Calcein。Calcein由于其极性增强而被滞留在细胞质中，从而实现对活细胞的标记。Calcein AM的这一特性使其成为细胞活性检测的理想选择，因为它能在不影响细胞正常生理功能的前提下，对活细胞进行荧光标记。
在细胞膜完整性的活细胞中，Calcein AM的细胞毒性很低，不会干扰细胞的正常代谢活动。这使得Calcein AM不仅可以用于短期的细胞观察，还适用于长时间的细胞培养和实验检测。Calcein AM的荧光信号强度与细胞内的酯酶活性相关，因此也可以间接反映细胞的代谢状态和活性水平。在细胞凋亡或坏死过程中，细胞膜的完整性遭到破坏，Calcein AM无法进入细胞或细胞内的酯酶活性降低，导致荧光信号减弱或消失，这为检测细胞活力和筛选具有细胞毒性化合物提供了便利。
Calcein AM常与PI（碘化丙啶）结合使用，实现活细胞和死细胞的双重染色。PI是一种核酸染料，不能穿透活细胞的完整细胞膜，但能与死细胞或细胞膜受损的细胞中的DNA结合，发出红色荧光。Calcein AM标记活细胞产生绿色荧光，PI标记死细胞产生红色荧光，二者结合使用可以在荧光显微镜下清晰地鉴别和定量分析活细胞与死细胞的比例。
在进行双重染色时，首先将Calcein AM和PI分别加入细胞培养体系中，按照各自的推荐浓度进行孵育。Calcein AM通常的使用浓度为1 - 10 μM，PI的使用浓度一般为1 - 10 μg/mL。孵育时间一般为15 - 30分钟，具体时间需根据细胞类型和实验需求进行优化。孵育完成后，使用荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。在荧光显微镜下，活细胞显示绿色荧光，死细胞显示红色荧光；在流式细胞仪中，可以通过设置相应的荧光检测通道，分别收集绿色和红色荧光信号，实现对活细胞和死细胞的定量分析。这种双重染色方法广泛应用于细胞毒性检测、药物筛选、细胞生物学研究等领域。通过精确分析活死细胞比例，研究人员可以评估化合物的细胞毒性、细胞培养的状态以及细胞对各种刺激的响应。
在进行Calcein AM染色之前，需要准备好细胞样本。对于贴壁细胞，可以使用胰蛋白酶消化收集细胞，然后用适当的缓冲液洗涤细胞，去除残留的培养基成分。对于悬浮细胞，直接收集细胞并进行洗涤。将细胞调整到合适的浓度，一般为1×10^5 - 1×10^6 cells/mL，以便于后续的染色和检测。
将准备好的细胞与Calcein AM染色液混合，Calcein AM的常用工作浓度为1 - 10 μM。将混合后的细胞悬液置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中孵育15 - 30分钟。在孵育过程中，Calcein AM会穿透细胞膜进入细胞内部，被细胞内的酯酶剪切转化为Calcein，产生绿色荧光。
孵育完成后，对于某些实验，可能需要去除未进入细胞的Calcein AM，以减少背景荧光。可以使用适当的缓冲液对细胞进行洗涤，但需注意操作轻柔，避免细胞损失。将处理后的细胞悬液或细胞涂片置于荧光显微镜下观察。在荧光显微镜下，活细胞会发出明亮的绿色荧光，细胞质中均匀分布着荧光信号。对于流式细胞仪检测，将染色后的细胞悬浮在适当的缓冲液中，进行流式细胞仪分析，通过设置488 nm的激发波长和515 nm左右的发射波长检测通道，收集绿色荧光信号，实现对活细胞的定量分析。
Calcein AM已被广泛应用于多种研究领域。在细胞毒性检测中，科研人员利用Calcein AM与PI双重染色，结合流式细胞仪分析，评估了多种化合物对细胞的毒性作用，为药物研发和毒性筛选提供了重要数据支持。在细胞生物学研究中，Calcein AM用于标记活细胞，观察细胞的迁移、增殖和代谢活动，揭示细胞在不同生理条件下的行为和机制。在细胞治疗研究中，Calcein AM用于标记治疗性细胞，通过实时监测细胞在体内的存活和分布情况，优化细胞治疗方案。
此外，Calcein AM还被用于细胞凋亡研究。在凋亡诱导实验中，Calcein AM可以显示细胞在凋亡过程中的荧光变化，帮助研究人员分析凋亡诱导剂的效果和凋亡发生的动力学特征。
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