碘化丙啶（PI）：细胞活力分析与死细胞检测的荧光探针

在细胞生物学研究中，准确区分活细胞和死细胞对于许多实验至关重要。碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）作为一种常用的细胞核荧光染料，以其工作机制和广泛应用成为细胞活力分析的得力工具。

一、PI 的染色原理与特性

PI 是一种溴化乙锭（EB）的类似物，能够嵌入双链 DNA 的碱基对之间。当 PI 与 DNA 结合后，会在 488 nm 的激发光下产生荧光，最大发射波长为 617 nm。PI 无法穿透活细胞的完整细胞膜，因此不能对活细胞进行染色。然而，对于死细胞或细胞膜受损的细胞，PI 可以自由进入细胞并与 DNA 结合，发出明亮的红色荧光。这一特性使得 PI 成为检测死细胞的理想选择。

PI 的荧光信号强度与细胞内 DNA 的含量成正比，这意味着它可以用于定量分析细胞内的 DNA 含量。此外，PI 的荧光信号稳定，不易受到光漂白的影响，这使得它在长时间的观察和检测中表现出色。

二、PI 在细胞活力分析中的应用

PI 广泛应用于细胞活力分析和死细胞检测。在细胞凋亡研究中，PI 可用于区分活细胞和死细胞。凋亡细胞的细胞膜完整性受到破坏，PI 可以进入细胞并与 DNA 结合，产生红色荧光。而活细胞的细胞膜保持完整，PI 无法进入，因此不产生荧光。通过荧光显微镜或流式细胞仪检测 PI 荧光信号，可以准确地评估细胞的存活率和死亡率。

PI 与 Calcein-AM 等活细胞荧光探针结合使用时，可以实现对活细胞和死细胞的双重染色。Calcein-AM 标记活细胞产生绿色荧光，PI 标记死细胞产生红色荧光。这种双重染色方法在荧光显微镜下可以清晰地显示活细胞和死细胞的分布情况，为细胞毒性检测、药物筛选和细胞生物学研究提供了有力支持。

三、PI 的操作使用方法

染色前准备

在进行 PI 染色之前，需要准备好细胞样本。对于贴壁细胞，可以使用胰蛋白酶消化收集细胞，然后用适当的缓冲液洗涤细胞，去除残留的培养基成分。对于悬浮细胞，直接收集细胞并进行洗涤。将细胞调整到合适的浓度，一般为 1×10^5 - 1×10^6 cells/mL，以便于后续的染色和检测。

染色过程

将准备好的细胞与 PI 染色液混合，PI 的常用工作浓度为 1 - 10 μg/mL。将混合后的细胞悬液置于室温下避光孵育 10 - 30 分钟。在孵育过程中，PI 会进入死细胞并与 DNA 结合，产生红色荧光。

染色后处理

孵育完成后，对于某些实验，可能需要去除未进入细胞的 PI，以减少背景荧光。可以使用适当的缓冲液对细胞进行洗涤，但需注意操作轻柔，避免细胞损失。将处理后的细胞悬液或细胞涂片置于荧光显微镜下观察。在荧光显微镜下，死细胞会发出明亮的红色荧光，而活细胞则不显示荧光。对于流式细胞仪检测，将染色后的细胞悬浮在适当的缓冲液中，通过设置 488 nm 的激发波长和 617 nm 左右的发射波长检测通道，收集红色荧光信号，实现对死细胞的定量分析。

四、PI 的应用案例与研究成果

PI 已被广泛应用于多种研究领域。在细胞凋亡研究中，科研人员利用 PI 染色结合流式细胞仪分析，评估了多种细胞类型在不同刺激下的凋亡率。在细胞毒性检测中，PI 与 Calcein-AM 双重染色方法被用于检测化合物对细胞的毒性作用，为药物研发提供了重要数据支持。在细胞周期分析中，PI 可用于染色细胞核 DNA，通过流式细胞仪分析细胞周期各阶段的 DNA 含量分布，揭示细胞周期调控机制。

此外，PI 还被用于细胞核形态学研究。通过荧光显微镜观察 PI 染色后的细胞核形态变化，研究人员可以分析细胞在不同生理和病理条件下的核变化特征。由于 PI 的荧光信号可以在 488 nm 激发下产生，它还可以与 FITC 和 PE 等其他荧光染料联合使用，实现多重荧光标记实验，为复杂生物过程的研究提供了更全面的视角。