培养基中EdU的掺入条件

EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷）替代BrdU掺入DNA合成期。贴壁细胞在正常培养基中加入EdU，终浓度10μM。处理时间根据细胞增殖速度设定：HeLa细胞2小时，原代成纤维细胞需12-18小时。超过24小时可能导致EdU掺入过多，背景增高。EdU工作液需新鲜配制，4℃存放超过一周会降解，表现为标记阳性率下降50%以上。

固定与通透的步骤顺序

先固定后通透。4%多聚甲醛室温固定15分钟，固定液需新鲜配制（储存超过一个月的多聚甲醛聚合，固定效果下降）。PBS洗涤3次，每次5分钟。通透使用0.5% Triton X-100，室温处理20分钟。注意：若先通透再固定，EdU标记的DNA片段会从核内扩散，出现胞浆阳性信号。对于细胞核轮廓模糊的样本，通透后增加一步0.1M甘氨酸封闭醛基，减少背景。

点击反应的试剂配制

点击反应（Click reaction）的组分：CuSO₄（2mM）、TCEP（2mM）、含叠氮基团的荧光染料（5μM）、TBTA（0.1mM）作为铜离子稳定剂。配制顺序：先混合TBTA与TCEP，再加入CuSO₄和荧光染料。TBTA在DMSO中配成10mM储存液，-20℃可保存6个月。反应液需在30分钟内使用，因为铜离子会催化荧光的非特异性氧化。每孔加入100μl反应液，室温避光孵育30分钟。

核复染与封片的选择

复染使用Hoechst 33342或DAPI。Hoechst 33342在活细胞中通透性好，固定后同样适用。终浓度1μg/ml，室温孵育10分钟。DAPI需要高浓度（2μg/ml）且孵育时间延长至15分钟。封片时使用抗荧光淬灭剂，含甘油和PVA的基质。避免使用含Tris的封片剂，因为Tris会与铜离子残留形成沉淀，产生颗粒状背景。封片后4℃避光存放，一周内完成成像。

图像采集的参数调整

宽场荧光显微镜设置：使用DAPI通道（激发360-400nm，发射420-470nm）拍摄细胞核；FITC通道（激发470-495nm，发射515-545nm）拍摄EdU标记。共聚焦显微镜：激光功率设置DAPI 5%，FITC 8%。曝光时间以核荧光强度接近饱和但不溢出为准。EdU阳性细胞的判定阈值：荧光强度是背景的3倍以上。每孔至少拍摄5个视野，每个视野计数200个细胞。注意用DAPI核信号确认细胞总数，避免因EdU标记不均导致计数偏差。

常见现象的处理

背景中出现非核点状荧光，原因是CuSO₄与荧光染料形成沉淀。过滤反应液（0.22μm滤膜）可以消除。标记阳性率低于预期，检查EdU是否失效（EdU储存液-20℃可保存6个月，反复冻融3次后失效），或者延长EdU处理时间。阳性率过高（超过80%且对照组也高），检查是否误加了EdU至所有孔，或者固定前洗涤不充分导致未掺入的EdU残留。用含0.1% Tween-20的PBS洗涤3次可降低背景。