Annexin V 与碘化丙啶（PI）联合使用是区分凋亡早晚期及坏死细胞的经典方法。理解其背后的分子机制才能正确解读流式结果。

磷脂酰丝氨酸外翻：凋亡的早期标志

活细胞膜脂质双层呈不对称分布。磷脂酰丝氨酸（PS）正常时仅存在于细胞膜的内侧小叶，由爬行酶和磷脂转运酶维持。凋亡信号启动后，胱天蛋白酶激活 scramblase 酶，同时抑制 flippase 活性。PS 在 1-3 小时内快速外翻到细胞膜外侧。Annexin V 是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白，对 PS 的亲和力处于纳摩尔级别。在钙离子存在下，Annexin V 与暴露的 PS 结合，每个 PS 分子可结合多个 Annexin V 形成晶格状结构。

FITC 荧光标记的作用

FITC（异硫氰酸荧光素）通过共价键连接到 Annexin V 的赖氨酸残基上。FITC 的激发峰位于 494nm，发射峰位于 518nm，对应流式细胞仪的 BL1 通道（525nm 带通滤光片）。每个 Annexin V 分子上标记 2-4 个 FITC 分子，保证荧光亮度而不影响蛋白结合活性。FITC 对 pH 敏感，在染色缓冲液 pH 低于 6.0 时荧光强度下降 50% 以上。钙离子浓度低于 0.5mM 时，Annexin V 无法发生构象变化，结合能力丧失。因此凋亡检测缓冲液必须含有 2-3mM 氯化钙。

碘化丙啶的膜不透性

PI 是一种核酸染料，分子量 668.4 Da。完整的活细胞膜和早期凋亡细胞膜排斥 PI。细胞膜结构损伤后，PI 进入细胞核，嵌入 DNA 双链的碱基对之间。PI 的激发峰 536nm，发射峰 617nm，进入 PE 通道（585/42nm）或 PerCP 通道。PI 不能穿过早期凋亡细胞的完整膜，因此与 Annexin V-FITC 联用时，流式散点图出现四个象限：

• 左下：FITC 阴性、PI 阴性，代表活细胞。

• 右下：FITC 阳性、PI 阴性，代表早期凋亡细胞。

• 右上：双阳性，代表晚期凋亡或坏死细胞。

• 左上：FITC 阴性、PI 阳性，极少出现，通常为机械损伤的裸核。

补偿调节的必要性

FITC 的发射光谱在 520nm 处有主峰，但在 570nm 处仍有约 20% 的溢出信号进入 PE 通道。PI 的发射光谱在 617nm 处，对 FITC 通道几乎没有溢出。流式细胞术需要设置 FITC 单染管（仅 Annexin V-FITC 染色的凋亡细胞）和 PI 单染管。调节 FITC 通道对 PE 通道的补偿，计算公式为 spillover = (PE 通道中 FITC 单染细胞的平均荧光强度) / (FITC 通道中同一群细胞的平均荧光强度)。补偿过量会压扁阳性群，补偿不足则出现斜向拖尾。

钙离子依赖的双重验证

实际操作中容易忽略钙离子的作用。部分研究者使用 PBS 稀释 Annexin V，导致钙离子缺失。此时 Annexin V 与 PS 的结合属于非特异性静电吸附，背景升高且早期凋亡信号消失。验证钙离子是否足量的简单方法：取一份热休克诱导的凋亡细胞样本，分别用含钙和不含钙的缓冲液染色。不含钙样本的 FITC 荧光强度应低于含钙样本的 10% 以下。