核心检测原理

磷脂酰丝氨酸外翻与凋亡识别

细胞凋亡是基因调控的程序性死亡过程，早期阶段伴随细胞膜不对称性的丧失。正常活细胞的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）严格分布于细胞膜内侧胞质面；当细胞进入凋亡程序，PS通过特定的翻转酶机制转移至细胞膜外侧，成为可被检测的"凋亡信号" 。

Annexin V 是一种分子量约35-36 kDa的钙依赖性磷脂结合蛋白，对带负电荷的PS具有高度亲和力。在Ca²⁺存在条件下，Annexin V与外翻的PS形成稳定复合物，从而标记早期凋亡细胞 。

双荧光通道区分细胞状态

Annexin V-AbFluor™ 405 细胞凋亡检测试剂盒采用蓝色/红色双荧光标记系统：

• Annexin V-AbFluor™ 405：激发波长404 nm，发射波长431 nm，蓝色荧光标记外翻PS，识别早期凋亡细胞

• 碘化丙啶（PI）：激发波长535 nm，发射波长617 nm，红色荧光标记DNA，识别膜完整性丧失的晚期凋亡或坏死细胞

通过流式细胞术或荧光显微镜分析，可在单一样本中同时区分三种细胞群：

AbFluor™ 405 染料的光谱优势

蓝色荧光通道的兼容性

AbFluor™ 405 染料在404 nm激发、431 nm发射的蓝色光谱范围内工作，与Alexa Fluor® 405、Cascade Blue®、DyLight™ 405等染料光谱特性相近 。该光谱区域具有以下实验优势：

• 多色实验兼容：蓝色荧光可与FITC（绿色）、PE（橙色）、APC（红色）等染料组合，实现多参数流式分析

• 低自发荧光背景：细胞自发荧光在蓝色波段较弱，信噪比相对较高

• 紫激光激发：适用于配备405 nm紫激光的流式细胞仪，如BD FACSCanto、Cytek Aurora等机型

荧光强度与光稳定性

AbFluor™ 405 染料经过优化，荧光强度和光稳定性与同类染料相当或更优 。在常规实验光照条件下，15-30分钟的染色孵育过程中荧光信号衰减可控，满足流式细胞术和荧光显微镜的检测需求。

标准操作流程

流式细胞术分析步骤

样本准备阶段

贴壁细胞需先用胰酶消化，消化时间控制在2-3分钟以内。过长的胰酶处理会破坏细胞膜结构，导致PS非特异性暴露，产生假阳性信号 。消化后使用培养基终止反应，300 g离心5分钟收集细胞。悬浮细胞直接离心收集，用冰预冷的PBS洗涤两次。

染色孵育阶段

将细胞重悬于100 μL 1× Annexin V Binding Buffer（含Ca²⁺），加入4-5 μL Annexin V-AbFluor™ 405和1-2 μL PI，轻柔混匀。室温避光孵育15分钟。Binding Buffer中的Ca²⁺是Annexin V与PS结合的必要辅因子，不可使用不含Ca²⁺的PBS替代 。

上机检测阶段

孵育结束后加入400 μL 1× Binding Buffer稀释，置于冰上。染色后30分钟内完成流式细胞仪检测。使用404 nm和535 nm激光激发，在431 nm和617 nm附近收集荧光信号 。

荧光显微镜分析要点

贴壁细胞可直接在爬片或腔室载玻片上染色。除去培养基后用PBS洗涤两次，加入工作液（每100 μL Binding Buffer含4-5 μL Annexin V-AbFluor™ 405和1-2 μL PI），室温避光孵育15-30分钟。注意此步骤不可使用PBS洗涤，必须使用Binding Buffer维持Ca²⁺浓度 。

染色后用Binding Buffer洗涤两次，滴加抗荧光淬灭封片剂，使用DAPI滤光片组（激发405 nm，发射420-470 nm）观察蓝色荧光，TRITC滤光片组观察红色荧光。

关键注意事项与常见问题

贴壁细胞消化后的恢复

胰酶消化会暂时破坏细胞膜完整性，使Annexin V能够结合到细胞膜胞质面的PS，导致假阳性染色。消化后的细胞需在培养基中恢复30分钟，期间轻轻晃动防止重新贴壁，待膜结构恢复后再进行染色 。对于HeLa、NIH 3T3等贴壁较松的细胞系，可考虑使用无酶解离液（如Cell Dissociation Buffer）替代胰酶。

钙离子依赖性结合

Annexin V与PS的结合严格依赖Ca²⁺。实验全程必须使用配套的Binding Buffer，不可用普通PBS或生理盐水替代。Binding Buffer稀释后需现配现用，长期存放可能导致Ca²⁺沉淀或pH变化 。

染色后不可固定

Annexin V染色需在活细胞状态下检测。如需固定，应使用含Ca²⁺和Mg²⁺的PBS配制的3.7%甲醛，固定后信号可部分保留。但透化处理会破坏膜结构，导致Annexin V信号丢失，因此该染色方法不可与胞内抗体标记联用 。

对照设置与补偿调节

流式细胞术检测时必须设置以下对照：

• 未染色对照：调节FSC/SSC电压，确定细胞群位置

• Annexin V单染对照：调节蓝色荧光通道电压，排除PI信号溢出

• PI单染对照：调节红色荧光通道电压，排除AbFluor™ 405信号溢出

• 双染样本：使用对照优化参数后采集数据

荧光补偿不当会导致假阳性或细胞群重叠。FITC-only对照细胞不应出现在PI阳性象限，反之亦然 。

假阳性排查

对照组出现高比例Annexin V阳性时，需排查以下因素：

• 细胞过度汇合或营养缺乏导致自发凋亡

• 胰酶消化过度或机械刮取造成膜损伤

• 药物或培养基成分产生自发荧光干扰

• 染色后延迟上机，凋亡进程继续发展

• 试剂盒过期或储存不当（应4℃避光保存，避免冻融）

技术参数与储存条件

应用场景

该试剂盒适用于药物筛选与毒理学评估、肿瘤学研究中化疗敏感性分析、免疫细胞活化与死亡状态评估、干细胞培养条件优化等领域。通过蓝色/红色双通道检测，可在多色流式实验中与FITC、PE、APC等标记组合，实现细胞凋亡与表面标志物或胞内因子的同步分析 。