PDH复合体将丙酮酸转化为乙酰辅酶A，连接糖酵解与三羧酸循环。测定其活性需要维持复合体的结构完整性，同时避免内源性磷酸化失活。

一、样品制备的低温操作规范

PDH复合体由E1（丙酮酸脱羧酶）、E2（二氢硫辛酰胺乙酰转移酶）和E3（二氢硫辛酰胺脱氢酶）三个亚基组成，总分子量约9.5 MDa。该复合体对温度敏感，4℃以上时E1亚基的硫胺素焦磷酸（TPP）结合能力每小时下降15%。

组织匀浆：

取50-100 mg新鲜组织（避免冻存，冻融一次活性损失40%），加入1 mL预冷匀浆缓冲液（50 mM K₂HPO₄/KH₂PO₄ pH7.0, 1 mM EDTA, 2 mM DTT, 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 1 mM苯-甲-基-磺-酰-氟-）。使用玻璃匀浆器手工匀浆（20次），冰上操作。不可使用超声破碎，超声产生的空化效应会解离PDH复合体。

细胞样本：

贴壁细胞用PBS洗涤后，加入200 μL匀浆缓冲液，细胞刮刀收集，冰上裂解10分钟。悬浮细胞以300×g离心5分钟，沉淀重悬于匀浆缓冲液。

去磷酸化预处理：

PDH活性受磷酸化调节（PDK激酶磷酸化E1亚基使其失活）。测定总活性前，需加入λ-磷酸酶（0.5 U/μg蛋白）和2 mM MnCl₂，30℃孵育15分钟，再加入20 mM NaF终止磷酸酶活性。若只测定去磷酸化状态活性（反映体内真实活性），则省略此步骤。

二、反应混合液配制与稳定性

标准反应体系（500 μL总反应体积）：

按顺序加入除丙酮酸钠外的所有组分，37℃预热5分钟。加入20-50 μL样品（含10-50 μg蛋白），再加入丙酮酸钠启动反应。空白对照不加丙酮酸钠，或用丙酮酸替代为等体积水。

三、反应进程监测与终止

连续监测法：

PDH复合体将NAD⁺还原为NADH，在340 nm处吸光度上升。摩尔消光系数ε₃₄₀ = 6.22 mM⁻¹cm⁻¹。使用石英比色皿（光径1 cm），37℃恒温。每30秒记录一次吸光度，持续5分钟。计算线性区（通常前2分钟）的ΔA₃₄₀/min。

活性计算公式：

活性（nmol/min/mg蛋白）= (ΔA₃₄₀/min × 反应总体积(μL)) / (ε × 光径(cm) × 蛋白量(mg) × 1000)

示例：ΔA=0.05/min，总体积500μL，蛋白0.05mg，ε=6.22 → 活性 = (0.05×500)/(6.22×1×0.05×1000) = 0.080 nmol/min/mg？计算有误，实际应为ΔA×总体积/(ε×蛋白mg) × 10^3? 正确公式：活性(nmol/min/mg) = (ΔA/min × 反应体积(mL) × 10^6) / (ε × 光径 × 蛋白(mg))。ε单位为M⁻¹cm⁻¹ = L·mol⁻¹cm⁻¹。所以ΔA=0.05，体积0.5mL，蛋白0.05mg，ε=6220 → (0.05×0.5×10^6)/(6220×1×0.05) = (25000)/(311) ≈ 80.4 nmol/min/mg。此值典型。

终点法（用于缺乏连续监测设备的实验室）：

反应进行10分钟后，加入50 μL 10%三-氯-乙-酸-终止。冰上放置5分钟，10,000×g离心5分钟。取上清测定NADH含量（340 nm吸光度）。同时制备NADH标准曲线（0-50 nmol/管）。

四、样品中内源性干扰物的排除

乳酸脱氢酶（LDH）干扰：

LDH催化丙酮酸还原为乳酸，消耗NADH，导致PDH测定中NADH生成速率被低估。解决方法：在反应体系中加入草氨酸（10 mM），选择性抑制LDH（抑制率>95%而对PDH无影响）。或预先用抗LDH抗体免疫沉淀去除。

NADH氧化酶干扰：

线粒体碎片中含有NADH氧化酶，将NADH重新氧化。在匀浆缓冲液中加入1 mM KCN（抑制细胞色素c氧化酶）或0.1 mM鱼藤酮（抑制复合体I），可阻断氧化酶活性。但KCN对后续部分实验有毒性，推荐使用鱼藤酮。

丙酮酸污染：

某些样品（如糖酵解活跃的肿瘤细胞）内源性丙酮酸浓度可达100 μM。设置不加外源丙酮酸的空白作为基线活性，从总活性中扣除。

五、活性单位的定义与参考范围

一个活性单位（U）定义为在37℃、pH7.0条件下，每分钟催化生成1 μmol NADH的酶量。

哺乳动物组织参考活性（总活性，经磷酸酶处理后）：

• 大鼠心脏：0.5-0.8 U/mg蛋白

• 大鼠肝脏：0.1-0.2 U/mg蛋白

• 大鼠脑：0.3-0.5 U/mg蛋白

• HEK293细胞：0.05-0.1 U/mg蛋白

若测得值低于实验室正常范围的60%，检查丙酮酸钠的有效性（丙酮酸溶液在4℃一周降解约30%，应每次新鲜配制并调节pH至7.0）。

六、常见错误与纠正

错误一：使用含有Triton X-100浓度超过0.5%的匀浆缓冲液。高浓度去垢剂解离PDH复合体的E3亚基，导致活性测定值偏低。应控制Triton X-100在0.1%以内。

错误二：未添加辅酶A或辅酶A被氧化。辅酶A的游离巯基氧化成二硫键后失去活性。可使用Ellman试剂（DTNB）测定辅酶A的巯基含量，412 nm吸光度应>0.8（对于10 mM储存液）。也可还原失效辅酶A：加入10 mM DTT，室温孵育30分钟。

错误三：样品反复冻融。PDH复合体在-80℃冻融一次活性下降20%，冻融三次下降60%。建议将样品分装成单次用量，直接解冻后使用，不可再次冷冻。