胞浆蛋白提取试剂盒（KTP3003）操作使用

样本预处理：决定提取效率的第一步

培养细胞需先去除培养基，用预冷的PBS漂洗两遍。贴壁细胞可用细胞刮刀收集，避免胰酶消化过度损伤蛋白。组织样本需剪切成小块，液氮研磨或匀浆器破碎，整个过程保持低温。

裂解液与蛋白酶抑制剂的配合

KTP3003试剂盒提供的裂解液含有温和的非离子去污剂，能选择性破坏胞浆膜而不溶解膜蛋白。每1mL裂解液需添加10μL蛋白酶抑制剂混合物，在冰上预混后使用。抑制剂失效是提取失败的主要原因，分装储存的抑制剂需避免反复冻融。

裂解操作的关键参数

加入裂解液后，用移液器反复吹打10-15次，冰上孵育20分钟。每5分钟涡旋震荡一次，每次5秒。过度震荡会导致核膜破裂，混入核蛋白；震荡不足则胞浆蛋白释放不-彻-底-。孵育时间不宜超过30分钟，否则去污剂可能开始溶解膜蛋白。

离心分离的转速与时间

4℃下以12,000×g离心15分钟。上清液即为胞浆蛋白组分。注意不可使用更高转速，否则微小细胞碎片会沉淀不-完-全-，污染上清。取上清时避免触及沉淀，建议保留约50μL液体在离心管中。

蛋白定量前的脱盐处理

提取的胞浆蛋白含有去污剂和高浓度盐，会干扰BCA法检测。推荐使用脱盐柱或透析方式处理小体积样本。若直接定量，需设置裂解液空白对照，并将标准品稀释于相同裂解液中。

分装与冻存规范

单次实验用量分装成小管，每管50-100μL。-80℃冻存可保存6个月。避免反复冻融，每次解冻后蛋白活性下降约15%-20%。使用前冰上解冻，不可加热或涡旋。