乳酸脱氢酶（LDH）检测：操作使用要点

样本采集与保存条件

LDH在室温下不稳定，全血中LDH活性每小时代谢下降5-10%。采血后2小时内分离血清或血浆，使用肝素或EDTA抗凝（枸橼酸钠抑制LDH活性）。离心条件：4℃，1500g，10分钟。血清或血浆在4℃可保存24小时，-20℃可保存1周，-80℃可保存3个月。反复冻融一次活性损失约15%。细胞培养上清直接检测或-80℃冻存。组织样本匀浆后立即测定，匀浆缓冲液使用PBS（pH 7.4）含0.1% Triton X-100。

反应体系的配制与加样顺序

采用逆向反应（丙酮酸→乳酸）速率更快。反应混合液：50mM Tris-HCl（pH 7.4），0.6mM丙酮酸，0.2mM NADH。将2.4mL反应混合液预热至37℃，加入0.1mL样本混匀，立即倒入1cm石英比色皿。加样顺序：先加缓冲液和NADH，预热后加丙酮酸启动反应，最后加样本（或样本与丙酮酸同时加）。记录340nm处吸光度每分钟下降值，连续监测3-5分钟。空白对照用缓冲液代替样本。

酶量优化与线性区间

LDH活性与ΔA340/min成正比。控制ΔA/min在0.05-0.15之间。ΔA<0.05时增加样本体积或稀释倍数的倒数（即浓缩样本）；ΔA>0.15时稀释样本。稀释使用PBS（含0.1% BSA稳定酶活性）。反应前60秒的线性区间用于计算，R²需≥0.995。若曲线弯曲（速率下降），说明NADH消耗超过20%或产物抑制，应减少样本量或缩短监测时间。

细胞毒性实验中的LDH释放操作

步骤：细胞接种于96孔板，处理相应时间。吸取上清100μL至新孔。同时设“最大释放组"（加10μL 10% Triton X-100或1% NP-40裂解细胞）、“自发释放组"（未处理细胞）、“背景组"（无细胞培养基）。加入100μL LDH反应混合液（含乳酸、NAD⁺、四唑盐），避光孵育30分钟，加入50μL终止液（1M醋酸），测490nm。计算公式：细胞毒性(%)= (实验组-自发组)/(最大组-自发组)×100%。注意：血清中含有LDH，使用无血清培养基或低血清培养基（<1% FBS）。

结果计算与单位换算

LDH活性（U/L）= (ΔA/min × 总体积ml × 1000) / (6.22 × 光径cm × 样本体积ml)。6.22为NADH在340nm的毫摩尔消光系数。若使用微孔板，光径校正为0.5cm。推荐使用标准品（Sigma LDH from rabbit muscle，活性标注500-1000 U/mg），配制0-500 U/L标准曲线。标准品用PBS稀释，与样本同条件测定。每批实验至少运行两个质控水平。

常见操作错误与纠正

气泡干扰：加样时避免气泡，比色皿中气泡导致光散射。NADH光降解：NADH溶液对光敏感，工作液需避光保存，当天配制。试剂污染：丙酮酸溶液易被细菌污染，4℃保存不超过2周。溶血样本：红细胞LDH活性是血清的100倍，轻微溶血即导致结果假性升高。溶血样本弃用，重新采血。高血脂样本：脂血导致浊度干扰，用聚乙二醇沉淀或高速离心（15000g，30分钟）去除。