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技术文章
更新时间：2026-04-12
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脂质过氧化是自由基攻击多不饱和脂肪酸（PUFA）引发的链式反应，导致细胞膜结构破坏和功能丧失。丙二醛（Malondialdehyde, MDA）作为脂质过氧化的终产物，具有相对稳定性，是评估氧化损伤的经典标志物。MDA可与蛋白质氨基交联形成荧光脂褐素，也可与硫代-巴-比-妥-酸-（TBA）反应生成红色产物，后者构成检测基础。
酸性条件下加热，MDA与TBA缩合生成红色产物（硫代-巴-比-妥-酸反应物，TBARS），在532-535 nm处测定。该方法操作简便，但特异性差：TBA除与MDA反应外，还可与蔗糖、葡萄糖、醛酮等反应生成类似有色物。需设置样本空白（不加TBA）扣除非特异性吸收。
TBARS在553 nm激发下发射600 nm荧光，灵敏度比色法高5-10倍（检测限约0.1 nmol/mL）。荧光法对样本浊度耐受性更强，但需配备荧光分光光度计，且仍受非MDA-TBARS干扰。
样本经TBA衍生后，用反相C18柱分离，荧光检测器定量。HPLC可分离MDA-TBA加合物与其他TBARS，特异性显著提高。保留时间约8-10分钟（流动相：磷酸盐缓冲液-甲醇体系），适合精确定量研究，但设备要求高、通量低。
针对MDA-蛋白加合物的单克隆抗体ELISA试剂盒，直接检测MDA修饰蛋白，无需衍生步骤。该方法反映"生物有效"MDA（参与病理过程的MDA），但标准品制备复杂，不同厂商抗体特异性差异大，需验证交叉反应。
新鲜组织用含BHT（丁基羟基甲苯，0.01%）的PBS匀浆，BHT作为抗氧化剂阻止离体脂质过氧化。匀浆后4℃ 3,000×g离心10分钟去除碎片，上清液立即衍生或-80℃保存。避免室温放置，离体组织持续产生MDA导致假性高值。
采血时添加EDTA抗凝和BHT（终浓度0.01%），4小时内分离血浆。血清制备过程可能激活血小板释放MDA，血浆更可靠。溶血样本需排除（血红蛋白干扰TBA反应），脂血样本需-乙-醚-提取去除甘油三酯。
悬浮细胞直接收集，贴壁细胞用细胞刮收集（胰酶消化可能损伤细胞膜产生MDA）。细胞数量建议1×10⁶-5×10⁶/检测，过少信号弱，过多TBA反应不-完-全-。细胞裂解液需立即衍生，冰浴放置不超过30分钟。
市售试剂盒主要为TBA比色法和ELISA法。TBA法成本低、通量高，适合初筛和大样本队列；ELISA法特异性好，适合机制研究。部分厂商提供"改良TBA法"（添加甲醇或正丁醇萃取TBARS），可降低水溶性干扰物影响。
优质试剂盒明确衍生条件：TBA浓度（通常0.67%）、反应温度（95℃水浴或煮沸）、反应时间（15-60分钟）、pH（2-3，用HCl或TCA调节）。-极-端-条件（如120℃高压）导致糖基化产物干扰，温和条件（60℃过夜）适合热敏感样本。
MDA标准品通常由1,1,3,3-四乙氧基丙烷（TEP）水解制备（1 mol TEP生成1 mol MDA）。需核查标准品配制说明：TEP需用0.1 M HCl 60℃水解60分钟生成MDA，直接使用TEP作为标准品会导致定量偏差。
反应管需加盖或覆膜防止水分蒸发（导致TBA浓度升高和pH变化）。水浴液面需高于反应液面，确保均匀加热。反应后冰水浴快速冷却终止反应，离心（1,000×g, 10分钟）去除沉淀蛋白，上清液测定。
正丁醇萃取可去除水溶性干扰物：衍生液与正丁醇等体积混合，振荡离心后取有机相测定。萃取损失约10%-15%，需设置萃取回收率对照。荧光法通常无需萃取，比色法建议萃取提高特异性。
比色法常规测定532 nm，但TBARS最大吸收实际在535 nm，532 nm可能低估高浓度样本。设置600 nm参比波长扣除浊度干扰，或计算ΔA=A₅₃₂-A₆₀₀。
蔗糖、葡萄糖在高温酸性条件下与TBA反应生成黄色产物（最大吸收450 nm），在532 nm处有肩峰。可通过双波长法（测定532 nm和450 nm）识别，或设置样本空白（不加TBA，加同等体积酸）扣除。
Fe³⁺催化脂质过氧化产生额外MDA，且与TBA形成有色络合物。添加EDTA（1 mM）螯合金属离子，或采用去铁胺（DFO）预处理。
样本处理过程引入氧气加速脂质过氧化，全程充氮或氩气保护。TBA试剂中可添加抗氧化剂（如BHT 0.01%），但需评估对衍生反应的影响。
MDA含量通常表示为nmol/mg蛋白（组织/细胞）或nmol/mL（体液）。蛋白浓度测定建议BCA法，Bradford法与TBA反应条件不兼容。细胞样本也可按细胞数标准化（nmol/10⁶ cells），但需确认细胞体积均一性。
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