一、NPSH检测原理简述

非蛋白质巯基（Non-protein Sulfhydryl, NPSH）是生物样本中不与蛋白质结合的游离巯基化合物统称，包括谷胱甘肽（GSH）、半胱氨酸等，在抗氧化、解毒等生理过程中发挥重要作用。检测NPSH常用显色反应法，核心原理是利用巯基（-SH）的还原性，与特定试剂发生化学反应生成有色产物，通过测定产物吸光度实现定量。

常用的试剂为5,5'-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB），其在碱性条件下与巯基反应，生成黄色的2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB），该产物在412nm波长处有特征吸收峰，吸光度与NPSH浓度呈线性关系，可通过分光光度法计算样本中NPSH含量。

二、实验前准备

1. 试剂准备

• DTNB溶液：称取适量DTNB粉末，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 8.0）溶解，浓度通常为0.1-0.5 mM。DTNB易被氧化，需现配现用或分装后-20℃避光保存，避免反复冻融。

• 缓冲液：常用PBS（pH 7.4-8.0）或Tris-HCl缓冲液（pH 8.0），用于维持反应体系pH稳定，需提前配制并灭菌（0.22μm滤膜过滤），4℃保存不超过1周。

• 标准品：选择还原型谷胱甘肽（GSH）作为标准品，用缓冲液配制系列浓度（如0-200 μM），现配现用，避免久置氧化。

• 样本预处理试剂：根据样本类型选择，如细胞样本需裂解液（含EDTA抑制金属离子氧化巯基），组织样本需匀浆缓冲液，血清样本可直接稀释。

2. 仪器与耗材准备

• 分光光度计：需支持412nm波长，使用前预热30分钟，校准波长准确性（可通过标准溶液验证吸光度稳定性）。

• 离心机：用于样本预处理（如细胞裂解后离心去沉淀，转速通常10000-12000 rpm，离心时间5-10分钟）。

• 移液器与耗材：10-1000 μL量程移液器（校准误差≤2%），无菌离心管（1.5 mL）、96孔板（石英或聚苯乙烯材质，确保412nm透光性）。

三、具体操作步骤

1. 样本预处理

• 细胞样本：收集对数期细胞，PBS洗涤2次，加入含1% Triton X-100的裂解液（含5 mM EDTA），冰上裂解30分钟，12000 rpm离心10分钟，取上清液待测（上清需无沉淀，避免干扰吸光度）。

• 组织样本：取新鲜组织（如肝脏、肾脏），用预冷PBS洗净-血-渍-，剪碎后按1:5（质量体积比）加入匀浆缓冲液，冰浴匀浆2分钟，10000 rpm离心15分钟，取上清待测。

• 血清/血浆样本：无需裂解，直接用PBS按1:5-1:10稀释（根据预期NPSH浓度调整稀释倍数，避免吸光度超出标准曲线线性范围）。

2. 标准曲线制备

• 在96孔板中，依次加入标准品溶液（0、20、50、100、150、200 μM GSH）各50 μL，每组3个复孔。

• 每孔加入DTNB溶液50 μL，轻轻震荡混匀，37℃避光反应15分钟（反应时间需严格控制，过长可能导致非特异性反应）。

3. 样本测定

• 在96孔板中加入样本上清液50 μL，同样加入50 μL DTNB溶液，37℃避光反应15分钟（与标准曲线同步反应）。

• 反应结束后，立即用分光光度计在412nm波长下测定各孔吸光度（空白孔为“缓冲液+DTNB"，用于扣除背景）。

4. 数据计算

• 以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线（线性回归方程：y = ax + b，R²需≥0.99）。

• 根据样本吸光度（扣除空白后）代入方程，计算样本中NPSH浓度，再根据样本稀释倍数和样本量（如细胞数、组织质量）换算为“nmol/mg蛋白"或“μmol/L"等最终单位。

四、关键注意事项

• 试剂稳定性：DTNB溶液暴露于强光或高温下易分解，配好后需用锡箔纸包裹容器，4℃保存不超过24小时；GSH标准品溶液需现配，若发现溶液变黄（氧化为GSSG），需重新配制。

• 样本时效性：巯基易被空气中的氧气氧化，样本处理需在冰上操作，离心后立即测定；若无法立即检测，可加入还原剂（如1 mM DTT）暂时保护，但需扣除DTT本身对巯基检测的干扰。

• 操作环境：避免在通风橱强气流下操作（可能加速巯基氧化），反应体系pH需严格控制在8.0左右（pH过高会导致DTNB自身水解，pH过低则反应速率减慢）。

• 仪器校准：分光光度计使用前需用标准溶液（如重铬酸钾溶液）校准波长，确保412nm处吸光度准确；96孔板需选择无划痕、透光均匀的板，避免因板间差异导致误差。

五、常见问题及处理

• 吸光度为负值：可能是空白孔吸光度高于样本孔，需检查空白组是否仅含缓冲液+DTNB，或样本中存在强氧化剂（如H₂O₂）破坏巯基，可在样本中加入少量还原剂（如1 mM抗坏血酸）中和。

• 标准曲线线性差：多因标准品配制误差（如移液不准确）或反应时间不一致，建议使用校准过的移液器，且所有孔同时加入DTNB并计时反应。

• 重复性差：可能是样本匀浆或裂解不均匀，需确保组织匀浆充分（可通过镜检确认无明显组织碎片），细胞裂解后离心时间足够（避免沉淀干扰）。