电泳迁移率的关键作用

彗星法检测DNA损伤的核心参数是电泳迁移率。迁移率数值直接反映DNA碎片在电场中的移动距离，迁移距离越长表明DNA损伤程度越高。实验室通常通过专业图像分析软件量化彗星尾长与头部直径的比值，该比值超过1.5时判定为显著损伤。迁移率的测量需控制在恒定电压0.6-1.0 V/cm范围内，温度维持在4℃以避免凝胶融化。

荧光染料选择与信噪比控制

溴化乙锭（EB）和SYBR Gold是常用的DNA染色剂，其荧光强度参数直接影响检测灵敏度。EB的激发/发射波长为518/605 nm，而SYBR Gold可达495/537 nm，后者信噪比提高约3.2倍。检测限要求达到可识别0.1%的DNA碎片，染料浓度需精确配置至2.5 μg/mL，偏差超过±0.2 μg/mL会导致荧光淬灭。

凝胶浓度与孔径规格

琼脂糖凝胶浓度通常采用0.6%-1.0%的梯度配置。浓度低于0.6%时孔径过大导致尾部分散，高于1.0%则抑制小碎片迁移。适配孔径尺寸为200-400 nm，允许DNA碎片自由移动而保持头部结构完整。每批次凝胶需测量流变参数，粘度系数应保持在12-15 cP范围内。

电场强度与缓冲液离子强度

电泳缓冲液（通常为TBE）的离子强度需维持在0.5-1.0 M的浓度区间。离子强度过低会引起电场不稳定，过高则产生焦耳热效应。电场强度参数设定为0.6 V/cm时，电泳时间20分钟可获得清晰彗星形态。电压超过1.5 V/cm会导致尾部分叉现象，影响定量准确性。

图像分析阈值设定

分析软件中需设定像素强度阈值，通常将背景荧光值设定为头部max强度的5%-8%。彗星尾矩（Tail Moment）的计算综合了尾长和尾部DNA占比，公式为：尾矩 = 尾长 × 尾部DNA含量/总DNA含量。阈值设定误差超过3%会使尾矩计算偏差达15%以上。

细胞裂解液渗透压参数

裂解液包含2.5 M NaCl、0.1 M Na₂EDTA和10 mM Tris-HCl，渗透压需保持在2800-3000 mOsm/kg。pH值严格控制在10.0±0.2，偏离此范围会使核膜破裂不完整。去污剂浓度如Triton X-100需为1%-2%，浓度不足会导致细胞质残留干扰电泳。