IP 工具箱里的“隐形量尺”：protein A/G 磁珠偶联密度如何决定抗体用量

KTD104-CN 把 protein A 密度锁在 55–60 µg mg⁻¹ 磁珠，1 mg 磁珠可结合 7–8 µg 兔 IgG。密度低于 40 µg mg⁻¹ 时，500 µL 样品里 1 µg 目标蛋白常常拉不下来；高于 70 µg mg⁻¹ 则抗体非特异填充，背景黑成一片。选磁珠先问偶联密度，再算抗体预算，否则 Co-IP 重复三次都看不见互作条带，只能把锅甩给“抗体亲和力差"。

粒径 1 µm 还是 2.8 µm：流速与背景的二选一

1 µm 磁珠沉降慢，10 min 可完成 4 次洗涤，适合高通量筛选。2.8 µm 磁珠表面积更大，protein G 载量高 30 %，但沉降快，每次得等 2 min 让磁架吸牢。做磷酸化信号时，1 µm 背景低；做低丰度互作蛋白时，2.8 µm 更省抗体。把实验目的写在实验记录本第一行，再决定拆哪盒磁珠。

封闭液配方：脱脂奶粉 3 % 会抢走protein A

protein A 与 Fc 结合靠疏水+盐桥，脱脂奶粉里 IgG 残留竞争结合，封闭一小时后磁珠载量掉 20 %。换用 0.5 % BSA + 0.05 % Tween-20，背景灰度从 18 降到 4，目标条带信噪比直接翻倍。封闭液写在试剂盒说明书小字部分，多数实验室直接跳过，结果 Western 一曝光就是一片黑云。

消化洗脱：0.2 M 甘氨酸 pH 2.5 会连 antibody 一起剥

粗暴酸洗把 protein A 一起拽下来，SDS 胶里 55 kDa 位置总有多余条带。换成 0.1 M 柠檬酸 pH 3.0 + 0.05 % Tween-20，洗脱 5 min 后立刻 1 M Tris 中和，IgG 重链留在磁珠上，下游质谱鉴定减少 30 % 污染谱。做 Co-IP-MS 时，这一步直接决定数据里是否出现“羊抗鼠"假阳性。

磁架磁场强度：0.4 T 以下 1 mg 磁珠需要 30 s

市场廉价磁架标 0.3 T，实际中心磁场只有 0.18 T，1 mg 磁珠吸壁时间 45 s，洗涤步骤手抖就丢珠。KTD104 配套磁架实测 0.55 T，1 µm 磁珠 10 s 贴壁，倒上清不用等，IP 做三重复误差条直接缩一半。

再生极限：NaOH 0.1 M 只能循环 5 次

protein A 在 0.1 M NaOH 里半衰期 15 min，CIP 3 次后载量掉 15 %，5 次后掉 40 %。把 CIP 换成 0.2 % 乙酸 + 0.5 M NaCl，寿命拉到 20 次，成本立刻降 4 倍。写 SOP 时把 NaOH 浓度和循环次数锁死，别让新人随手抓 0.5 M NaOH 泡一晚，第二天整盒磁珠直接报废。

低温存储：2–8 °C 会结露，−20 °C 会结冰

磁珠悬液含 20 % 甘油，−20 °C 冷冻一次就出现冰晶划痕，protein G 脱落 10 %。改放 4 °C 却反复开合盖子，瓶壁水珠稀释浓度，1 个月后磁珠沉成一团。正确姿势：分装 100 µL 小管，Parafilm 封口，−80 °C 速冻，用前室温解冻手温回温，一管一次性用完，背景干净得像新盒。

现场验收：拉一条已知互作就算合格

新到一盒 KTD104-CN，用 500 µL 细胞裂解液 + 2 µg anti-GAPDH，拉 GAPDH 同时看 band 强度，灰度值 ≥ 上一批 90 % 即签字收货。5 min 跑完验收，比测粒径、测浓度省事，现场工程师当场就能判定退货还是留用。