一文了解PI双染细胞凋亡检测

PI双染细胞凋亡检测是流式细胞术中经典的细胞周期与凋亡分析方法，通过特定荧光染料对细胞DNA含量的差异结合特性，区分正常细胞、凋亡细胞及坏死细胞。该方法操作简便、结果直观，在肿瘤研究、药物筛选及免疫学等领域广泛应用。

一、PI双染细胞凋亡检测原理

PI是一种核酸嵌入型荧光染料，其检测核心基于​​细胞膜通透性改变​​与​​DNA含量差异​​两大特性：

1.​​活细胞/早期凋亡细胞​​：细胞膜结构完整，PI无法穿透，无荧光信号。

2.​​晚期凋亡细胞/坏死细胞​​：细胞膜破损后，PI进入细胞并与DNA结合，发出​​红色荧光(激发光488nm，发射光617nm)​​，荧光强度与DNA含量成正比。

3.​​细胞周期区分​​：通过PI染色DNA荧光强度，可进一步将细胞分为G0/G1期(2N)、S期(2N-4N)和G2/M期(4N)，凋亡细胞因DNA片段化会在G1峰前出现​​亚二倍体峰(Sub-G1峰)​​。

常与PI联用的染料还有 ​​Annexin V-FITC​​(磷脂酰丝氨酸结合蛋白)，二者组合(Annexin V-FITC/PI双染)可更精准区分：早期凋亡细胞(Annexin V+ PI-)、晚期凋亡/坏死细胞(Annexin V+ PI+)、活细胞(Annexin V- PI-)及机械损伤细胞(Annexin V- PI+)。

二、实验流程

1.​​样本制备​​：收集贴壁或悬浮细胞(通常1×10⁵-1×10⁶个)，用PBS轻柔洗涤。

2.​​固定与通透​​(仅PI单染分析亚G1峰时)：用70%乙醇固定细胞(-20℃过夜)，或直接检测悬浮细胞;若需结合Annexin V，则先用不含EDTA的胰酶消化，避免破坏膜蛋白。

3.​​染色​​：加入适量PI染料(终浓度通常50μg/mL)，避光室温孵育15-30分钟(若用RNA酶需提前处理去除RNA干扰)。

4.​​检测​​：上机通过流式细胞仪检测，激发光488nm，收集红色荧光信号(FL2或FL3通道)，结合前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)参数排除碎片干扰。

三、PI双染细胞凋亡结果解读

•​​亚G1峰​​：PI单染时，凋亡细胞因DNA断裂形成小片段(<2N)，在G1峰左侧出现低DNA含量的亚二倍体峰，峰面积占比反映凋亡比例。

•​​Annexin V/PI双染图谱​​：四象限分析中，右下象限(Annexin V+ PI-)为早期凋亡(膜磷脂酰丝氨酸外翻但膜完整);右上象限(Annexin V+ PI+)为晚期凋亡/坏死(膜破损);左下象限(Annexin V- PI-)为活细胞;左上象限(Annexin V- PI+)多为机械损伤或晚期坏死细胞。

四、应用与注意事项

该技术广泛应用于：肿瘤药物筛选(观察化疗药诱导凋亡效果)、免疫细胞杀伤功能检测(如CTL对靶细胞的杀伤)、辐射/氧化应激损伤研究等。需注意：PI具有强荧光背景，操作需严格避光;乙醇固定可能导致某些细胞聚集，需过滤处理;Annexin V检测更适合早期凋亡分析，而PI单染侧重DNA片段化定量。

PI双染通过简单高效的荧光标记，为细胞凋亡研究提供了定量依据，是实验室评估细胞命运的关键工具之一。