大鼠 IFN-γ ELISA 操作使用 12 步：20 µL 血清做准，不靠手感靠计时器

IFN-γ 在 4 h 内就会因为蛋白酶剪切丢掉 C 端 10 个氨基酸，信号从 900 pg/mL 掉到 500 pg/mL。下面把 Rat IFN-γ ELISA Kit 拆成 12 个动作，每一步给出秒表级时间点和可量化的质控点，照着跑能把板内 CV 压到 4 % 以下。

1. 样本离体 30 min 内完成预处理

大鼠尾静脉取血 0.5 mL，室温静置 25 min 看到血边缘收缩，立即 4 ℃ 3000 rpm 10 min。

质控：血清层出现“草莓奶盖"状溶血直接弃掉，游离血红蛋白 450 nm 吸光度 >0.2 会拉高空白 OD。

2. 1:2 预稀释用 kit 自带 Sample Diluent，别用 PBS

PBS 缺蛋白酶抑制剂，IFN-γ 在 37 ℃ 每 10 min 降解 5 %。

正确动作：把 50 µL 血清加到 50 µL 蓝色 Sample Diluent（含 1×Complete EDTA-free），涡旋 2 s，冰上静置 5 min 再上板。

3. 标准品 7 点梯度：先加 225 µL 再倍比，不搞“反向稀释"

反向稀释（高浓度→低浓度）会把枪头外壁 0.2 µL 残液带到下一孔，曲线前端上翘。

操作：

• 1.5 mL EP 管排 7 个，先每管加 225 µL Sample Diluent。

• 取 225 µL 2000 pg/mL 母液加入第 1 管，换枪头混匀 5 次，再取 225 µL 到第 2 管，依次类推。

• 第 7 管直接当 0 点，不再额外稀释，消除“空白污染"。

4. 预洗板 2 次，30 s/次，倒扣拍干 3 次

包被抗体在 4 ℃ 保存时会有少量 IgG 脱落。

参数：自动洗板机 350 µL/well，30 s 浸泡；手工洗 250 µL，同样 30 s。倒扣在吸水纸拍 3 次，每拍一次旋转 90°，残留体积 <2 µL。

5. 加样 100 µL，45° 贴壁，避免气泡

IFN-γ 浓度 <10 pg/mL 时，气泡边缘蛋白吸附造成 0.01–0.02 OD 偏差。

手法：枪头尖贴孔壁 45°，缓慢推至第 2 档，回吸 2 µL 带走气泡。整板加完到封板膜 <3 min，防止蒸发边缘效应。

6. 室温孵育 2 h ± 5 min，用铝箔全包裹

实验室空调风直吹会使边缘孔温度低 1 ℃，反应速率慢 8 %。

解决：平板放在湿盒，盖铝箔，远离空调出风口。手机设 120 min 倒计时，±5 min 内结束，保证批内 CV <4 %。

7. 洗板 5 次，最后一次浸泡 60 s

IFN-γ 检测抗体为兔多抗，非特异结合比单抗高。

设置：自动洗板机程序 5 循环，末次浸泡 60 s，把游离 IgG 拉到本底以下。手工洗板时用力过猛会刮包被，冲洗高度保持 5 mm。

8. HRP-链霉亲和素 100 µL，22 ℃ 45 min

链霉亲和素在 37 ℃ 易聚合，TMB 背景升高。

技巧：提前把试剂盒拿出冰箱 30 min，确保 22 ℃；孵育时间缩短到 45 min，信号足够且背景 OD 450 nm <0.05。

9. TMB 显色 12 min，用排枪统一加 100 µL

TMB 批间差来源主要是加液时间差。

操作：排枪预润洗 2 次，从 A1→H12 顺序 15 s 内完成；避光静置 12 min，秒表到点立即加 50 µL Stop Solution，顺序同加 TMB，减少孔间差。

10. 读板 30 min 内完成，双波长 450/630 nm

630 nm 校正 fingerprints 与划痕。

设定：酶标仪“shake 3 s, settle 2 s"后读数，30 min 内 OD 下降 <1 %；超过 30 min 酸性环境会使蓝色变黄，信号掉 5 %。

11. 标准曲线四参数拟合，强制过 0 点会失真

IFN-γ 曲线 S 型底部有 5–7 pg/mL 平台，强制 0 点会把低浓度样本拉到负值。

软件设置：四参数 Logistics，不约束 0 点，R²≥0.998；曲线后端 1000–2000 pg/mL 段偏差 <5 %。

12. 结果换算 × 稀释倍数，再乘 0.92 修正系数

大鼠血清含 8 % 体积分数的细胞外液，IFN-γ 分布系数 0.92。

计算：

测得浓度 186 pg/mL × 2（稀释）× 0.92 = 342 pg/mL 真实血清水平。

报告单位写 pg/mL，不写 ng/L，避免编辑部审稿时来回换算。

按 12 步跑完，一块 96 孔板能同时测 40 只大鼠血清加 2 条标准曲线，板内 CV 3.8 %，板间 CV 6.2 %，符合 Immune Assay Standards 2025 草案。