永生化 Cas9 Expressing 人心肌细胞 - SV40 Cell Line：技术参数全解

基因背景与构建策略

SV40 大 T 抗原片段长度 2.7 kb，插入位点选在 AAVS1 安全港，利用 CRISPR/ Cas9 敲入后通过嘌呤霉素筛选。Cas9 表达框由 CAG 启动子驱动，两侧配置 WPRE 与 bGH polyA，保证心肌细胞高转录活性下的持续表达。测序验证显示，Cas9 编码区无点突变，插入纯合率 > 98 %。

体外增殖与表型维持

倍增时间 28 ± 2 h，连续培养 50 代未见形态学漂移。肌节 α-actinin 呈典型横纹排列，跳动频率 55 ± 8 bpm，与新鲜分离的新生大鼠心肌细胞共测无差异。SV40 表达量随代次上升，但 p53 通路保持沉默，说明永生化机制稳定。

Cas9 活性定量数据

• SpCas9 切割效率：针对 PCSK9 位点 T7E1 检测 87 %

• 全基因组脱靶：GUIDE-seq 检测 0 个高置信位点

• indel 精度：> 90 % 为 1 bp 插入，便于后续精确建模

电生理参数

冻存与复苏规格

冻存密度 5 × 10^6 cells/mL，冻存液配方 90 % FBS + 10 % DMSO。复苏后 24 h 贴壁率 ≥ 85 %，48 h 恢复同步跳动。每批次附带液氮温度记录曲线，确保运输全程低于 −70 °C。

配套培养体系

• 基础培养基：StemPro-34 SFM + 2 % B-27

• 抗生素：Primocin 100 μg/mL，抑制支原体而不干扰 Cas9 表达

• 基质涂层：0.1 % 明胶 + 5 μg/mL 纤维连接蛋白，48 h 内无需换液

质检报告必须包含的项目

1. STR 图谱与原始供体匹配度 100 %

2. 支原体 qPCR Ct ≥ 38

3. Cas9 Western blot 条带单一，分子量 160 kDa

4. 心肌标志物 cTnI、Nkx2.5 免疫荧光双阳性率 ≥ 95 %

常见实验适配性

• 基因敲除：单 gRNA 文库筛选，48 h 内完成 > 500 个位点

• 碱基编辑：与 ABEmax 共转染，A-to-G 效率 72 %

• 电穿孔参数：1600 V, 10 ms, 3 pulses，细胞存活率 85 % 以上

安全与合规

SV40 序列不含复制起点，无法包装成病毒。细胞携带的 Cas9 为核酸酶活性型，实验室需按照 NIH rDNA 指南进行 BSL-2 管理。出口需提供 ECCN EAR99 声明。