永生化人毛囊内根鞘细胞系-SV40+hTERT 技术参数全景解析

掌握一套可量化的指标，才能让实验设计有据可依。

基因组改造图谱：双元件整合位点与拷贝数

SV40 Large T 抗原与 hTERT 分别靶向 p53/Rb 和端粒酶途径。优质细胞系采用 PiggyBac 转座子双顺反子载体，实现 1:1 单拷贝整合。数字 PCR 验证显示：

• SV40T：1.0 ± 0.1 copy/diploid genome

• hTERT：1.1 ± 0.1 copy/diploid genome

整合位点落在安全港 AAVS1 区域，避免插入突变；全基因组测序未发现脱靶断裂 >50 bp 的片段。

增殖动力学：从 PDL 曲线到群体倍增时间

连续 60 代培养绘制 PDL 曲线，线性回归斜率 0.92，群体倍增时间 26.4 ± 1.2 h。关键节点：

• P10 前：生长速率无漂移

• P30：端粒长度 8.2 kb，仍高于衰老阈值 5 kb

• P50：核型 46, XY 保持完整，未见非整倍体克隆扩增

表型指纹：蛋白与转录组双维度基准

RNA-seq 比对显示，与原代 hIRS 的皮尔逊系数 0.93，关键毛发生长通路 Wnt、BMP、FGF 均无显著差异表达。

培养体系参数：微环境变量一次给全

• 基础培养基：DMEM/F12 1:1，碳酸氢钠 1.2 g/L

• 补充因子：rhKGF 10 ng/mL、ITS-X 1×、BPE 0.2 %、Y-27632 2 µM（前 48 h）

• 包被基质：重组人层粘连蛋白-511 E8 5 µg/cm²

• 气体条件：37 °C，5 % CO₂，可选 5 % O₂ 低氧延缓应激

• 传代比例：1 : 4 每 3–4 天，TrypLE 3 min 消化，存活率 ≥ 95 %

质量控制阈值：放行标准与警戒值

功能验证数据：体外重建毛囊的硬指标

• 3D 悬滴培养 7 天，形成 KRT71+ 球体，直径 90–110 µm

• 与小鼠真皮乳头细胞共培养 14 天，诱导出毛干样结构，β-catenin 核转位阳性率 78 %

• CRISPR-Cas9 单切割效率 75 %，双等位基因敲除效率 42 %，HDR 模板插入效率 28 %

储存与运输规格

• 冻存密度：1 × 10⁶ cells/mL，90 % FBS + 10 % DMSO

• 冻存管：2 mL 内旋盖，二维码可追溯

• 干冰运输：-70 °C 以下 48 h 温控记录

• 有效期：液氮气相存储 5 年，复苏存活率 ≥ 90 %