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细胞水平上定量 ALDH 活性的实验,第一步往往是挑选一只“趁手"的试剂盒。市面上的产品从显色法到荧光法、从 96 孔到 384 孔、从冻干粉到即用型液体,差异巨大。下面拆解核心要素,帮助你在采购时一眼看穿参数背后的真实含义。
显色法以 NAD⁺→NADH 的 340 nm 吸收为信号,线性范围 0.05–0.5 mM,适合常规细胞裂解液。荧光法利用 NADH 激发 Ex/Em 340/460 nm,灵敏度提升到 0.01 mM,可检测低至 10³ 个细胞的 ALDH 活性。若样本是流式分选的干细胞亚群,直接选荧光法,避免信号淹没在背景噪声里。
试剂盒说明书会给出“线性区间"——例如 0.1–1.5 mU/mL。拿到这个数先算稀释倍数:
悬浮细胞 1×10⁶ 个/mL,裂解后总蛋白 1 mg/mL,ALDH 活性 0.8 mU/mg → 原液 0.8 mU/mL
目标落在区间中点 0.75 mU/mL,仅需 1:1 稀释即可上机
遇到肝癌组织等高表达样本,提前用裂解缓冲液稀释 5–10 倍,避免信号超出仪器检测上限导致返工。
NAD⁺ 浓度固定 1 mM 是行业惯例,但 pH 和离子强度常被忽视。标准配方采用 Tris-HCl pH 8.5,若你的样本来自酸性微环境(如肿瘤核心),pH 漂移 0.3 个单位即可使 Km 值翻倍。选购时优先选含缓冲液独立包装的型号,可现场微调至 8.0–8.7。
冻干酶粉 4 °C 可存 12 个月,但复溶后需在 24 h 内用完。液体即用型 4 °C 保存 4 周,适合高通量平台每天连续上机。对周期不固定的课题,冻干试剂盒是更经济的选择;对一周跑 3–4 次板的实验室,液体试剂盒可减少人为复溶误差。
细胞培养常用的 DMSO、EDTA、β-巯基乙醇都可能抑制 ALDH 活性。购买前索取“抑制剂耐受表",确认试剂盒在 0.1% DMSO 或 1 mM EDTA 条件下回收率 ≥90%。若样本需添加 1% DMSO 溶解药物,直接选耐受上限 2% 的型号,省得额外做有机溶剂对照。
以 96 孔规格为例:
A 品牌 ¥2800/100T → 每孔 ¥28
B 品牌 ¥3200/500T → 每孔 ¥6.4
留意标注“T"是反应次数还是孔数。部分品牌把 100T 拆成 50 孔×2 次反应,实际每孔成本翻倍。